Szelektív templát lebontáson alapú mutagenezis módszerek

A Smith és Hutchinson által kifejleszett irányított mutagenezis módszer (ld. 11.2.) hatékonysága igen kicsi.

Elméletben a mutációs ráta maximum 50%-os lehet, de a gyakorlatban a nem megfelelő oligonukleotid letapadás, a polimerizáció és a ligálás hiányos működése miatt a legjobb esetben is csak pár százalékot ér el.

A módszer hatékonyságának növelése érdekében az újonnan létrejövő mutációt tartalmazó plazmid DNS-t szelekDNS-tálni kell a vad DNS-típusú plazmid DNS-DNS-től.

11.2.2.1. Kunkel mutagenezis

A rekombináns fehérjék irányított mutagenezisének egyik legrégebbi, de néhány területen még a mai napig is használatos módszerét Thomas Kunkel 1985-ben közölte (ld. 11.3. ábra). A módszer nagy

hatékonysággal képes általunk meghatározott pozícióban inszerciók, deléciók és pontmutációk

létrehozására. A módszer alapja, hogy a mutálandó DNS inszertet egy M13 bakteriofág alapú egyszálú DNS fágmid tartalmazza. Erre, mint templátra, a mutációt tartalmazó oligonukleotidot anellálnak, majd T7 DNS-polimeráz használatával szintetizálják a már mutációt tartalmazó új szálat. A mutációt tartalmazó plazmid végül megfelelő baktérium törzsekben szelektálható.

Az első lépés a mutálandó DNS inszert M13-alapú fágmidba klónozása. Az inszertet tartalmazó fágmidból ezután egyszálú DNS-t hoznak létre, ami a mutagenezis során templátként fog szolgálni. A M13 fágmid

149 vektor ötvözi a kétszálú DNS plazmidok és az egyszálú DNS fág tulajdonságait, amiről nevét is kapta (ld.

bővebben a 7.3.2. fejezetben). E. coli sejtekben képes kétszálú DNS plazmidként szaporodni (ez az ún.

replikatív forma). M13 helper fág hatására azonban egyszálú DNS másolatok jönnek létre, amelyek a helper fág által termelt M13 bakteriofág burokfehérjéibe csomagolódva M13 virionokat alakítanak ki. Az M13 bakteriofág egy nem-litikus bakteriofág, a kialakuló virionok a baktérium kultúra felülúszójába

szekretálódnak, feldúsulnak, ahonnan könnyen tisztíthatók és belőlük egyszálú DNS izolálható.

11.3. ábra: Kunkel mutagenezis módszer sematikus ábrája. A mutálandó DNS fragmentumot hordozó fágmidból egyszálú, uracil tartalmú DNS templátot állítunk elő dut-, ung- E. coli baktériumtörzsben. A mutációt tartalmazó, szintetikusan előállított oligonukleotidot a templát DNS-re anelláljuk, majd T7 DNS polimerázzal „körbeírjuk“ azt, végül az újonnan szintetizált szálat T4 ligázzal cirkularizáljuk. A duplex DNS-t dut+, ung+ E. coli baktériumtörzsbe

transzformáljuk, melyekben a mutáns szál szelektálódik és a vad típusú szál lebomlik. A mutáns fágmid tovább szaporítható, belőle kétszálú vagy egyszálú DNS hozható létre.

Második lépésben az egyszálú templát DNS-hez a mutációt tartalmazó oligonukleotidot anellálnak. Egy mutációs lépésben akár több oligonukleotid is használható, így egymástól távolabb található DNS szakaszok egyszerre is megváltoztathatók. A következő lépésben T7 DNS-polimeráz használatával történik meg az egyszálú templát fágmid „körbeírása”, a kétszálú heteroduplex DNS létrehozása (az egyik szál az eredeti

„vad típusú” templát, a másik szál a mutáns). A T7 DNS polimeráz egy processzív polimeráz, azaz képes hosszú, akár másodlagos szerkezettel rendelkező templát átírására is anélkül, hogy a templát szálról disszociálódna. Érdemes az oligonukleotidok 5’- és a 3’-végére lehetőleg G/C bázisokat tervezni, hogy elkerüljük a rossz helyre anellálást (mispriming) és ezáltal a nem-megfelelő termékek keletkezését. A 3’-végen található G/C bázispárok biztosítják a T7 DNS- polimeráz pontos működéséhez szükséges kezdő

150 pozíciót. Az oligonukleotid 5’- végén található G/C bázispárok pedig megakadályozzák a T7 DNS

polimeráz túlműködését, az oligonukleotid 5’ végének a templát DNS szálról való „letúrását”. Az újonnan szintetizált, már a mutációt tartalmazó DNS szálat T4 ligáz segítségével cirkularizálják. A T4 DNS-ligáz működéséhez szükséges a szintetikusan előállított oligonukleotid 5’ végének foszforilálása, amit az oligonukleotidnak a templát szálhoz való hozzáadása előtt polinukleotid-kináz enzimmel lehet elvégezni.

A kialakuló kétszálú heteroduplex DNS fágmidot E. coli sejtekbe transzformálják és így a továbbiakban plazmidként szaporítható. Smith módszeréhez hasonlóan az ilyen módon létrehozott fágmidoknak a legjobb esetben is csak az 50%-a fogja tartalmazni a mutációt. A Kunkel-módszer során ez az 50%-os mutációs ráta a templát DNS szál szelektív lebontásával csaknem 100%-ig eltolható. Ennek alapja, hogy a templátként szolgáló egyszálú fágmid timin helyett nagyrészt uracilt tartalmaz. Ezt úgy érik el, hogy az egyszálú DNS templátot olyan E. coli törzsben szaporítják, ami dUTP-áz és uracil N-glikozidáz deficiens (E. coli CJ236 K12 dut-, ung-, F pilus+). A dUTP-áz hiánya miatt a fágmid DNS szintézise során a sejtekben a dUTP koncentrációja megnövekszik és timin helyett gyakran uracil is beépül a DNS-be. Az uracil N-glikozidáz felelős a DNS-be már beépült uracil eltávolításáért, ezért az uracil N-glikoziláz deficiens törzs nem tudja kijavítani a DNS-be már beépült uracilt. A mutációt tartalmazó második szál T7 DNS-polimerázzal történő in vitro elkészítéséhez dUTP-t nem használnak fel, ezért az újonnan szintetizált szál uracilt nem tartalmaz. A következő lépésben a vad típusú, uracilt tartalmazó, és a mutáns, uracilt nem tartalmazó heteroduplex DNS-t vad típusú E. coli törzsbe (dut+, ung+) transzformálják (E. coli XL1-Blue vagy DH5-alpha). Az uracilt tartalmazó vad típusú DNS a dut+, ung+ E.coli sejtekben az uracil-N-glikoziláz enzim hatására preferenciálisan lebomlik, míg a mutáns változat jóval nagyobb arányban fennmarad, így növelve meg a mutációs rátát. A sejtekből a mutáns kétszálú fágmid plazmid tisztítható, illetve M13 helper fág

használatával fág és egyszálú fágmid is termelhető.

A módszer előnye, hogy ha a mutálandó inszertet a továbbiakban is fágmid vektorban szeretnénk

fenntartani, akkor ez nem igényel további klónozási lépéseket, mint például restrikciós endonukleázzal való emésztést vagy ligálást. Hátránya, hogy a fágmid vektoroknak korlátozott az alkalmazhatósága, így például ha a vizsgálandó rekombináns fehérjénket heterológ expresszióval E. coli baktériumban szeretnénk

túltermeltetni, akkor a mutációt tartalmazó inszertet szubklónoznunk kell megfelelő expressziós vektorba (pl. pET). A heterológ expresszióról a 12. fejezetben találhatók további részletek.

11.2.2.2. QuickChange mutagenezis

A Stratagene cég által kifejlesztett „QuickChange” mutagenezis az irányított mutagenezis módszerek közül, mint neve is mutatja, talán a leghatékonyabb és leggyorsabb módszer (ld. 11.4. ábra). Deléció, inszerció és szubsztitúció is létrehozható vele. Előnye, hogy nem igényel speciális vektorrendszert, mint a Kunkel mutagenezisnél alkalmazott M13 fágmid, valamint összehasonlítva a PCR-alapú „megaprimer”, vagy az

„overlapping” mutagenezis módszerekkel (ld. 11.2.3.1. és 11.2.3.2.), nincs szükség további klónozó lépésekre (restrikciós emésztés, ligálás) sem.

A módszer során a mutálandó DNS fragmentumot bármilyen kétszálú plazmid tartalmazhatja. A

kivitelezésnek előfeltétele, hogy a használni kívánt plazmid vektor guanin bázisai metiláltak legyenek. E feltétel teljesítése bármely géntechnológiában általánosan használt (dam+) E. coli törzs esetében teljesül, mint például az XL1-Blue vagy a DH5-alpha törzsek esetében (ld. 7. fejezet). A plazmidot vagy lúgos oldattal (NaOH kezeléssel), vagy hőkezeléssel denaturálják. A mutagenezishez olyan oligonukleotid primer párt használnak, melyek ugyanazon DNS-szakasz két szálához hibridizálnak és tartalmazzák a kívánt mutációt. A primerek tehát egymás komplementerei. Érdemes nagyon magas (Tm> 78°C) olvadási hőmérsékletű oligonukleotidot tervezni. Az olvadási hőmérsékletet megbecsülhetjük a következő egyszerű képlet használatával:

Tm = 81.5 + 0,41(GC%)  675/N  mismatch%

ahol az N az oligonukleotid hossza, a GC% és a mismatch% egész számok. Egyszerre több primerpár használatával több, akár egymástól távolabbi DNS szakaszon is létrehozhatunk változást. A következő

151 lépésben egy PCR során DNS-polimeráz (Pfu, KODI, Fusion/Phusion) használatával történik meg a

mutációt tartalmazó új szálak szintézise.

A reakció végül vad típusú és mutációt tartalmazó plazmidokat és ezek heteroduplexeit eredményezi. A következő lépésben a reakcióterméket DpnI restrikciós endonukleázzal kezelik, ami képes magas sókoncentráció mellett (150-200 mM NaCl) specifikusan a metilált DNS lebontására, így a vad típusú templát plazmidok eliminálására (célszekvenciája: 5´-Gm6ATC-3´). A kezelés után a mutációt tartalmazó plazmidok intaktak maradnak. A DpnI enzimmel kezelt mintát, amely elvileg már csak a metilálatlan, mutáns plazmidokat tartalmazza, E. coli baktériumba transzformálják, ahol megtörténik a plazmid két végének ligálódása. A DpnI endonukleáz és a DNS-polimeráz minőségétől függően általában maximum 50%-ban sikeres a reakció. A mutáció hatékonysága 80-100%-ra növelhető, ha uracilt tartalmazó templátot használunk és a mutagenezis után a DNS termékünket dut+, ung+ E. coli baktérium sejtekbe

transzformáljuk. Az uracil tartalmú templátot dUTP-áz és uracil N-glikoziláz deficiens E. coli baktérium sejtekben állíthatjuk elő (E. coli CJ236 K12 dut, ung, F pilus+).

11.4. ábra: QuickChange mutagenezis sematikus ábrája. A módszer során bármilyen, dam+ E. coli sejtben termelt kétszálú, metilált plazmid használható. A plazmidok hő- vagy lúgos denaturációja után mindkét szálra komplementer, a mutációt hordozó oligonukleotidot anellálnak. T7 polimeráz és T4 ligáz szintetizálja és cirkularizálja az újonnan képződő, a mutációt már hordozó szálat. A metilált, vad típusú DNS-t DpnI endonukleázzal magas sókoncentráció mellett specifikusan lebontják. A reakcióterméket mutS- E.coli sejtekbe transzformálják, melyekben a mutáns szál

szelektálódik és szaporodik. Az ábrán a piros csillag a mutációt jelöli.

A „QuickChange” mutagenezis előnye a Kunkel-módszerrel szemben, hogy nem igényel speciális

sejtvonalakat és vektorrendszereket. A PCR alapú módszerekkel szembeni előnye pedig, hogy nincs szükség további klónozási lépésekre. Hátránya, hogy az egész plazmid átírásra kerül, ezért nagyon jó minőségű, nagy

152 hűségű DNS-polimerázt igényel. Nagyméretű plazmidok esetén (> 8 kbp) ezért speciális körülményeket és enzimeket kell használni (részletesebb leírást a gyártó cég honlapján itt olvashatnak).

11.2.2.3. GeneEditor mutagenezis

A Promega cég által kifejlesztett „szelekciós” oligonukleotidra épülő „GeneEditor” módszere a

„QuickChange” mutagenezis egyik alternatívájaként szolgál. Minden általánosan használt ampicillin rezisztenciát (TME1 -laktamáz) hordozó egyszálú és kétszálú plazmidban kódolt DNS fragmentum irányított megváltoztatására alkalmas (ld. 11.5. ábra). A mutáció során egyszerre két oligonukleotidot használnak fel. Az egyik magát a kívánt mutációt tartalmazza. Egyszerre egymástól távolabb található több mutáció is létrehozható több mutációs oligonukleotid együttes használatával. A másik típusú, az úgynevezett „antibakteriális szelekciós” oligonukleotid, a plazmidon kódolt ampicillin rezisztencia gént (TME1 -laktamáz) módosítja. A módosított rezisztens plazmidot tartalmazó sejtek így nemcsak ampicillint tartalmazó táptalajon, hanem „GeneEditor™ Antibiotic Selection Mix”-et tartalmazó táptalajon is

fenntarthatók. Első lépésben a plazmidot denaturálják, majd az oligonukleotidok anellálása után T4 DNS-polimeráz enzimmel és T4 DNS-ligáz enzimmel szintetizálják és cirkularizálják a mutációkat tartalmazó új szálat (mutáció a -laktamázban és a vizsgálandó DNS inszertben). A ligáláshoz itt is szükséges az

oligonukleotidok 5’ végének előzeteses foszforilálása. A mutagenezis terméket kompetens E. coli sejtekbe transzformálják, melyeket ampicillin és „GeneEditor™ Antibiotic Selection Mix”-et tartalmazó táptalajon növesztenek. Ezen a táptalajon csak azok a sejtek nőnek fel, melyek a kívánt, mutáns plazmidot

tartalmazzák. A mutagenezis hatásfoka növelhető, ha a reakcióterméket E. coli BMH 71-18 mutS baktériumtörzsbe transzformálják. Az így elérhető mutációs ráta gyakran nagyobb, mint 90%.

11.5. ábra: A GeneEditor mutagenezis sematikus ábrája. A módszerrel TME1 -laktamáz alapú ampicillin rezisztenciát hordozó plazmid által kódolt DNS inszert szekvenciáját lehet tetszőlegesen változtatni. A vektor hő- vagy lúgos denaturálása után oligonukleotidok használatával két parallel mutációt történik. Az egyik a vizsgálandó DNS inszerten, a másik a -laktamázt kódoló génen. A szintézis (T4 DNS-polimeráz) és a cirkularizáció után (T4-ligáz) vad típusú és kétszeresen mutáns szálakat kapunk. A terméket E. coli mutS- baktériumtörzsbe transzformáljuk,

majd „GeneEditorTM Antibiotic Selection Mix”-et tartalmazó táptalajon növesztjük, így csak a megváltoztatott -laktamáz szekvenciát kódoló plazmidot tartalmazó sejtek szelektálódnak.

153