4. Alapmódszerek és rekombináns DNS konstrukciók tervezése
4.1. Alapmódszerek
4.1.1. A DNS tisztítása és analízise
A rekombináns DNS-ek előállítása a vektor és a majdani inszert DNS tisztításával kezdődik. Ezt követően meg kell győződnünk a DNS pontos méretéről, mennyiségéről és tisztaságáról. A DNS izolálása az RNS-hez képest egyszerűbb, mert az RNS esetében nehéz megszabadulni a szinte mindenhol jelen lévő RN-áz
enzimektől. Ez az alfejezet a DNS előállításához és izolálásához szükséges oldatokat, reagenseket, a tisztításhoz használt módszereket (pl. „miniprep”) és a DNS koncentrációmérés lehetőségeit mutatja be.
4.1.1.1. Oldatok, reagensek
A vektor DNS-t baktérium tenyészetekben állítjuk elő, s ugyanezeket a tenyésztési körülményeket használjuk a rekombináns DNS felszaporításához is a molekuláris klónozás során. A baktériumok tenyésztéséhez, növekedéséhez táptalajra van szükségünk. Leggyakrabban steril LB (Luria-Bertrani;
összetétele: tripton, élesztő kivonat, NaCl) vagy 2YT (több élesztő kivonatot és triptont tartalmaz) médiummal dolgozunk. A mikrobiológiában használatos táptalajok lehetnek folyékonyak és szilárdak.
Szilárd táptalajt úgy kaphatunk, ha a sterilezést megelőzően valamilyen szilárdító anyagot keverünk a tápleveshez, leggyakrabban agart. Magas hőmérsékleten az agar feloldódik, majd a kihűlés előtt Petri-csészékbe öntjük, és hagyjuk megdermedni (agar lemez). A 4.1. ábraán folyadék és szilárd halmazállapotú táptalajokat mutatunk be. Nagy mennyiségű baktériumsejt felnövesztéséhez folyékony táptalajra van
szükség, de abból az egyedi klónokat nem tudjuk szétválasztani. Azért kell a szilárd táptalaj, hogy a
sejtszuszpenziót hígan eloszlatva, az egyedi klónok egymástól szétválasztható egyedi telepeket képezzenek.
4.1. ábra: Folyadék és szilárd halmazállapotú táptalajok. Az agar lemezen az egyedi baktériumtelepek látszanak.
40 Nagy mennyiségű plazmid DNS előállításához először a felszaporítani kívánt plazmidot (ld. 7.2. fejezet) kompetens E.coli baktériumokba kell transzformálni (ld. 4.3.1.). Ahhoz, hogy kizárólag a plazmidot felvett baktériumsejtek növekedjenek, a táptalajhoz valamilyen antibiotikumot is kell adni, hiszen a plazmidot felvett sejtek rendelkeznek legalább egy antibiotikum rezisztenciát kódoló génnel (ld. 7.1.2. fejezet), és így tovább tudnak osztódni, míg az „üresen” maradt sejtek elpusztulnak (szelekció).
4.1.1.2. Plazmid DNS preparálás
A felszaporítandó plazmidot tartalmazó baktériumsejtekkel folyékony táptalajt inokulálunk, és egy éjszakán át, 37°C-on növesztjük, majd a sejteket centrifugálással összegyűjtjük. A baktériumsejtekből történő DNS izolálás klasszikus módszere az ún. alkalikus lízis, amely során SDS-t tartalmazó NaOH oldattal tesszük tönkre a sejtmembránt és denaturáljuk a makromolekulákat. (Birnboim and Doly dolgozták ki ezt a módszert 1979-ban). A sejtek feltárását elérhetjük enzimekkel (lizozim, proteináz K) vagy mechanikai hatással is (pl.
szonikálás ultrahanggal, nagy nyomás az ún. French-press módszernél, többszörös fagyasztás-felolvasztás).
Az oldatba került DNS molekulákat el kell választani a többi sejttörmeléktől és fehérjéktől. Az óriási méretű kromoszomális DNS-t (3,6 Mbp) könnyen ki lehet csapni (neutrális pH-n), az RNS-eket és a különböző fehérjéket enzimekkel lehet degradálni. A fenol-kloroform-izoamilalkoholos extrakció esetén a fenol és a kloroform, mint szerves oldószerek denaturálják a fehérjéket, a plazmid méretű (2-10 kbp) nukleinsavak viszont a vizes fázisba kerülnek. Az izoamilalkohol csökkenti a bifázisos oldat habosodását. Végül a DNS-től etanollal vagy izopropanollal vonjuk el a vizet és ezzel csapjuk ki, majd centrifugálással kiülepítjük az extrakromoszomális plazmid DNS-t egy műanyag Eppendorf-cső falára. Az alkohol eltávolítása után vízben vagy Tris-EDTA (TE) pufferben visszaoldjuk a tiszta DNS-t.
A nyers lizátum tisztításának egy másik hagyományos módja a CsCl-os sűrűséggradiens centrifugálás, amit manapság már ritkábban használnak, mivel fél napos nagy fordulatszámú (350.000 g) ülepítés szükséges hozzá. Viszont nagy tisztáságú DNS-t lehet vele kinyerni, és épségben maradnak a nagyobb méretű (>10 kbp) DNS molekulák is, amelyek mechanikailag érzékenyek a pipettázásnál is fellépő nyíróerőkre. A 4.2. ábra a CsCl sűrűséggradiens centrifugálás sémáját mutatja be.
4.2. ábra: A sűrűséggradiens centrifugálás sémája. Erős centrifugális erő hatására a nehéz Cs+ ionok sűrűséggradienst képeznek. Centrifugálás hatására a CsCl oldatban lévő makromolekulák különböző helyzetű sávokat
alkotnak a gradiensben (pl. a DNS molekulák izopiknikus pontja 1,6-1,8 mg/ml CsCl koncentrációnál van). A DNS sávok elhelyezkedését UV fényben lehet detektálni a fluoreszcens festéknek köszönhetően. Az izolált DNS-ről végül
n-butanollal az etídium-bromid, dializálással a CsCl választható el.
41 Az eddig ismertetett módszerek hátránya, hogy nagy elővigyázatosságot igényel a mérgező reagensek (pl.
fenol, etídium-bromid) és a veszélyes hulladék miatt, drága eszközök (pl. ultracentrifuga) szükségesek hozzá és rendkívül időigényesek. A kis mennyiségű bakteriális DNS („miniprep”) alkalikus lízisen alapuló
kivonására manapság számos, kereskedelemi forgalomban kapható kit áll rendelkezésre, melyekkel nagy tisztaságban és mennyiségben lehet kinyerni a plazmid DNS-t. Ezek a kitek alapvetően a részletesen ismertetett alkalikus lízis módszerén alapulnak, de a fenolos extrakciós lépés helyett egy szilikát tartalmú oszlopon (vagy membránon) történő tisztítást tartalmaznak. A minipreppel általában 10-100 µg DNS-t lehet kinyerni. Vannak olyan kitek is, amelyekkel jóval nagyobb mennyiségű DNS-t is lehet tisztítani. A
„midiprep” módszernél kb. 25-50 ml sejtkultúrából indulunk ki, és 100-350 µg DNS-t kaphatunk. Ennél több DNS „maxi-” „mega-” és „gigaprep”-pel (100 ml-5l sejtkultúra, 500 µg-10 mg DNS) állítható elő.
„Miniprep” protokoll-leírásokat többek között itt találnak az interneten.
4.1.1.3. A DNS koncentráció meghatározása
A plazmid DNS koncentrációját leggyakrabban fotometriával mérjük. A nukleinsavak elnyelési maximuma 260 nm-nél van az aromás gyűrűk miatt. Az elnyelés alapján megadható a DNS koncentrációja. Ha az abszorbancia A260 = 1, ez az érték megfelel 50 µg/ml duplaszálú DNS-nek (37 µg/ml egyszálú DNS-nek vagy 40 µg/ml RNS-nek). A fehérjék elnyelési maximuma 280 nm-nél van, tehát különbözik a DNS-étől, ezért könnyedén megállapítható a minta fehérje szennyezettsége is, melyet az A260 / A280 hányados határoz meg pontosan. Ha ez az érték kevesebb, mint 1,8, akkor a minta fehérjével szennyezett. Ha viszont 2 felett van, akkor RNS-t is tartalmazhat. A mérést elvégezhetjük hagyományos UV fotométerben, de ehhez sok anyagra van szükségünk. Ma már legtöbbször ún. nanodrop technikát alkalmazunk (ld. 4.3. ábra), melynél egy csepp (~2 µl) DNS koncentrációját mérjük egy speciális spektrofotométerben.
4.3. ábra: DNS koncentráció mérése nanodrop technikával
4.1.2. Gélelektroforézis
Mindenfajta gélelektroforézis azon az elven alapul, hogy a töltéssel rendelkező molekulák az elektromos térben az ellentétes töltésű elektróda felé vándorolnak. A vándorlás sebességét a töltésen kívül a molekula alakja és mérete határozza meg. Ez a három tulajdonság teszi lehetővé, hogy különböző minőségű és pórusméretű gélekben az eltérő tulajdonságú biomolekulákat elválasszuk egymástól.
4.1.2.1. Agaróz gélelektroforézis
Az agaróz a vörösmoszatok agar-agarjának egyik poliszacharid összetevője, mely a D-galaktóz és 3,6-anhidro-L-galaktopiranóz lineáris polimere. Rendkívül jól alkalmazható nukleinsavak szeparálására. A biokémiában az agaróz gélelektroforézis DNS molekulák, elsősorban méret és alak szerinti elválasztására szolgál. Agaróz gélben néhány 10 bp-tól több 10 kbp-ig terjedő méretű (hosszúságú) DNS molekulákat
42 lehet szétválasztani. A DNS molekula negatív töltése cukorfoszfát gerince miatt egyenesen arányos a hosszúságával. Ezért egy vízszintesen elhelyezett agaróz gélben (horizontális gélelektroforézis) a pozitív pólus felé vándorló DNS molekulák mobilitása arányos lesz a hosszukkal. Az agaróz 0,5-2%-os oldata forralással készül. Dermedéskor az agaróz térhálós szerkezetű lesz. A forralást követően a gélhez
interkaláló fluoreszcens festéket is adunk, amely a DNS-t UV fényben láthatóvá teszi. Régebben a már korábban is említett etídium-bromidot (ld. 4.4. ábra) alkalmazták erre a célra, azonban ez erősen mutagén hatású, ezért manapság más, biztonságosabb festékeket használunk helyette (pl. SYBR Safe, Gel Green).
4.4. ábra: Az etídium-bromid fluoreszcens DNS-festék szerkezeti képlete
A gél öntésekor, az öntő formára merőlegesen, felülről egy ún. "fésűt" is elhelyezünk, ami a mintafelvitelhez szükséges zsebeket fogja kialakítani. A fésű méretét a minta mennyiségétől függően választjuk ki. A
dermedt gélből óvatosan kivesszük a fésűt, és a zsebekbe pipettázzuk a mintánkat, majd egy elektródákkal ellátott kádba helyezzük a gélt. Az elektroforézishez szükséges egyenáramot a tápegység biztosítja. Minden egyes mintához "DNS-kezelő" oldatot is keverünk, mely glicerint és általában kétféle festéket is tartalmaz.
A glicerin arra szolgál, hogy nagyobb sűrűsége révén a mintákat a zseb alján tartsa, ne diffundáljanak ki a pufferbe. A festékek segítségével pedig megállapítható, hogy hol tart az elektroforézis. A brómfenolkék láthatóvá teszi felvitelkor a mintát, és kiváló mobilitási képességei következtében (1%-os gélben egy 300 bp-os DNS fragmentummal fut együtt) sötétkék színe a futási frontot jelzi. A xilén-cianol nagyon lassan halad a gélben (kb. 4 kbp DNS-sel fut együtt).
Az elektroforézishez használt puffer (TBE: Trisz-borát-EDTA vagy TAE: Trisz-acetát-EDTA) ionerőssége fontos tényező a DNS elektroforetikus mobilitása szempontjából. Túl alacsony ionerőn a DNS csak lassan képes haladni, míg ha túl magas az ionerő, akkor a vezetőképesség is növekszik, túl sok hő képződik, amitől a gél meg is olvad. Alacsony feszültségen a lineáris DNS vándorlási sebessége arányos a feszültséggel. A megfuttatott gélt végül UV fénnyel világítjuk meg, s a gélhez adott fluoreszcens festéknek köszönhetően világítani fognak a DNS-ek sávjai a gélben. A láthatóvá vált DNS sávokat ki is vághatjuk a gélből további tisztításra, felhasználásra.
Az agaróz gélelektroforézis kivitelezését a 4.5. ábra és a a 4.1. videon szemléltetjük.
4.5. ábra: agaróz gélelektroforézis
43
4.1.2.2. Poliakrilamid gélelektroforézis (PAGE)
A nukleinsavakat nemcsak agaróz, hanem poliakrilamid gélelektroforézissel (PAGE) is el tudjuk választani egymástól. A PAGE-t a horizontális agaróz elektorforézistől eltérően vertikális (függőleges) elrendezésű készülékben végezzük (ld. 4.6. ábra). A poliakrilamid gél egyik legjelentősebb eltérése az agaróz géltől, hogy sokkal kisebb a pórusmérete. Felbontása 5-2000 nukleotidig terjed, és képes elválasztani az akár 1 nukleotid hosszban különböző oligo- vagy polinukleotid szálakat is egymástól. A Sanger-féle klasszikus DNS szekvenálás során PAGE-vel választják el a különböző hosszúságú lineáris, újonnan szintetizált egyszálú DNS-eket egymástól. Megjegyzendő, hogy az automata DNS szekvenátorokban kapilláris elektroforézist használnak (ld. 5.2.2. fejezet), amihez más szintetikus polimereket alkalmaznak. Az akrilamid vizes közegben, megfelelő iniciátorok (pl. peroxidiszulfát) és katalizátorok (tetrametil-etilén-diamin, TEMED) jelenlétében gyökös polimerizációra képes, és nagy mólsúlyú lineáris polimer,
poliakrilamid keletkezik. A térhálós szerkezet a keresztkötő ágens (N,N-metilén-bisz-akrilamid) jelenlétében alakul ki, aminek segítségével a hosszú poliakrilamid láncok között hidak képződnek. Megjegyzendő, hogy a fehérjék elválasztására is PAGE-t használunk, mivel még a nagyobb méretű fehérjék (>100 kDa) is jóval kisebbek, mint egy kisméretű plazmid (1 kbp ~ 600 kDa).
4.6. ábra: Poliakrilamid gélelektroforézis készülék „kamráinak” felöltése mintákkal.
Mivel a különböző hosszúságú DNS molekulák relatív töltése azonos (a foszfát-csoportok negatív töltése miatt), ezért a lineáris molekulák mindig méret szerint válnak szét. Ha valamilyen denaturáló ágenst is keverünk a gélhez, például ureát, akkor a lineáris DNS szálak alakja is egyforma lesz, így ténylegesen csak a méret alapján szeparálódnak. Fehérjék esetében is hasonló az elválasztás elve, de fehérjék szeparálására a PAGE számos más változatát is használjuk (2D PAGE, SDS-PAGE, izoelektromos fókuszálás).
4.1.2.3. A DNS-ek méretének meghatározása
A DNS méretét ismernünk kell, ha azt analizálni vagy preparálni szeretnénk. A lineáris DNS molekula méretének logaritmusa és az elektroforetikus mobilitása között fordított arányosság van (a mobilitás és a méret logaritmusa között lineáris az összefüggés). Így egy ismeretlen molekula mérete meghatározható a futási távolság ismeretében, ha mellé olyan DNS molekulákat is felviszünk a gélre, amelyeknek a mérete pontosan ismert. Ez a DNS „létra” vagy molekulasúly marker, ami különböző méretű lineáris DNS molekulák keveréke. Az agaróz gélt alapvetően nagyobb méretű nukleinsavak elválasztására használják, mivel pórusmérete jóval nagyobb a poliakrilamid gélhez képest. A gél agaróz vagy akrilamid
koncentrációjától függően, különböző méretű polinukleotidokat lehet elválasztani. Minél hígabb, annál nagyobb, minél töményebb, annál kisebb DNS szálakat lehet szeparálni. Minden vizsgálandó mintához
44 tartozik egy optimális pórusméret, amelyben a molekulák bizonyos ellenállással vándorolnak, de nem
akadnak fel, hanem képesek haladni benne.
A hosszabb molekulák a gélben „nehezebben” haladnak, így ezek lemaradnak a rövidebb, kisebb
molekulákhoz képest. A polinukleotidok gélben való mobilitását nagyban befolyásolja az alakjuk is. A cirkuláris/relaxált plazmid formák széttekeredettségük miatt lassabban haladnak, mint az erősen kondenzált, szuperhelikális DNS-ek. A linearizált plazmidok pedig az előbb említett két forma között mozognak (a molekulák alak-szerinti mobilitását a gélben alapvetően a hidrodinamikai térfogatuk dönti el. DNS minták agaróz gélelektroforetikus képét a 4.7. ábra mutatja.
4.7. ábra: Agaróz gél DNS létrával és különböző DNS mintákkal. A mintákat valamilyen restrikciós endonukleázzal (1- vagy 2-féle) kezeltük. A 3. minta kivételével a DNS minták kettévágódtak, ezért két különböző
méretű sávban futnak. A 3-as plazmid DNS minta cirkuláris maradt. A kondenzáltabb szuperhelikális formák gyorsabban, míg a relaxált, kitekeredett molekulák lassabban vándorolnak a gélben. A DNS létrával a molekula
méreten kívül a DNS mennyiségét is meg lehet becsülni.
4.1.2.4. DNS-ek izolálása agaróz gélből
A megfelelő DNS-t (pl. vektor vagy inszert DNS), melyet pl. restrikciós emésztés vagy PCR reakció eredményeként kaptunk, az agaróz gélből izolálnunk kell ahhoz, hogy megfelelően elválasszuk a DNS mellett maradt enzimektől (endonukleázok, DNS-polimeráz) vagy a hasítatlan vektortól.
Az agaróz gélelektroforézist követően a gélt ebben az esetben UV fény helyett kék fényben világítjuk meg, mert az UV roncsolná az izolálni kívánt DNS-t. A gélhez adott DNS festék (etídium-bromid helyett pl.
SYBR Safe) ugyanis kék fényben is fluoreszkál, ami lehetővé teszi a megbízható, károsodásmentes DNS izolálást. A gélből a megfelelő csíkot egy szikével vágjuk ki (ld. 4.8. ábra), amiből a DNS-t többféle módon is kinyerhetjük.
Az izolálás történhet elektroelúcióval, amikor a kivágott géldarabot egy olyan dializáló membránba helyezzük, ami impermeábilis egy bizonyos DNS molekula méretre, és permeábilis a folyadékokra. TE pufferbe áztatjuk a géldarabot tartalmazó dialízis zacskót, és elektromos teret hozunk létre a dialízis cső körül. Ugyanúgy, ahogy a gélelektroforézisnél is, a DNS elkezd vándorolni a pozitív elektróda felé. Ebben az esetben kivándorol a gélből, de nem juthat át a membránon. A dialízis zacskóból ezután csak ki kell pipettázni a már tiszta DNS-t tartalmazó folyadékot.
45 4.8. ábra: DNS agaróz gélből izolálása steril szikével
A DNS-t tovább lehet még tisztítani fenolos extrakcióval és etanolos kicsapással. Egy másik hagyományos módszer a géldarab 80°C-on történő fagyasztása. Ezen a hőmérsékleten az agaróz szerkezete már
roncsolódik, így egy szűrőn keresztül, centrifugálással kinyerhető a DNS. Egy további kivonási eljárás az alacsony hőmérsékleten megolvadó (low melting) agaróz használata, mivel az oldatfázisba került DNS-t a miniprep módszernél ismertetett szilika membránhoz történő adszorbcióval könnyen tisztíthatjuk. A DNS (és RNS) gélből történő extrakciójára sokféle kit kapható a kereskedelemben.
4.1.2.5. Restrikciós térképezés
A különböző restrikciós endonukleázok eltérő felismerő szekvenciákkal rendelkeznek, így ugyanazon DNS molekulát különböző enzimekkel emésztve különböző restrikciós fragmentumok keletkeznek. A restrikciós enzimeket önmagukban vagy kombinálva alkalmazzuk, és a kapott DNS fragmentumokat
gélelektroforézissel választjuk el. A fragmentumok mérete alapján össze tudjuk állítani az eredeti DNS molekula ún. restrikciós térképét (ld. 4.9. ábra).
4.9. ábra: Rekombináns DNS konstrukció térképezése restrikciós endonukleázokkal
46 Ez egy „kirakós játék”, ami azon alapszik, hogy a hasítóhelyek egymáshoz viszonyított helyzete dönti el, hogy melyik emésztésnél milyen méretű fragmentumok keletkeznek. Akár egy teljes genomot is fel lehet így térképezni (ld. 9.1.1. fejezet). Az ilyen mintázat minden embernél más és más – ezt DNS ujjlenyomatnak nevezik és több célra is fel tudják használni (ld. 4.1.3.2. fejezet).