Bakteriális promóterek és a riboszóma kötőhely 1. Promóterek

A bakteriális expressziós vektorok általában plazmid-alapúak, amelyek legtöbbször indukálható promótert tartalmaznak. Már korábban megtanultuk, hogy a prokarióta promóternek két fontos eleme van: a Pribnow-box vagy -10 elem (TAAATA konszenzus szekvencia), ami 10 bp-ra található 5’-irányban az első átírandó bp-hoz képest (amely a +1 pozíciót jelenti). Ezen elem jelenléte esszenciális a transzkripcióhoz. A másik elem egy TTGACA konszenzus szekvencia, amit -35 szekvenciának is hívunk, mert a start ponttól 35 bp-ra található upstream, azaz 5’-irányban az átíródó szekvenciától. Jelenléte a promóterben nem esszenciális, de jelentős mértékben hozzájárul a gén átírásához. Végül sok prokarióta promóterben a 35 elemtől

5’-irányban további nem esszenciális szekvenciák is találhatók („UP” elemek). Egy tipikus bakteriális promóter fő elemeit a 12.4. ábra mutatja be.

12.4. ábra: Egy bakteriális promóter sémája

A bakteriális promóterek lehetnek állandó kifejeződést biztosító, azaz konstitutív, vagy indukálható promóterek. Az indukció történhet hőmérséklettel, vagy valamilyen kémiai ágenssel, induktorral. Az indukció leggyakrabban IPTG-vel (izopropil-tiogalaktozid) történik, ami egy nem metabolizálódó laktóz analóg. Így az indukció a lac-operon szabályozási elvén alapul, azaz az expressziós vektor a promóter mellett tartalmazza a lac operátor szekvenciát is (a -10 elem és az átíródó szekvencia között). Az induktor (allolaktóz vagy IPTG) hiányában a lac-represszor fehérje kötődik ehhez a szekvenciához, így nem hozzáférhető az RNS-polimeráz számára a promóter, tehát nincs mRNS átírás. Allolaktóz vagy IPTG jelenlétében a lac-represszor leválik a promóterről, megtörténik a génátírás. Ráadásul, az IPTG mennyiségével még az átírás mértékét is szabályozni tudjuk.

Lac promóter (lavUV5 promóter): Általánosan elterjedt, ilyen van a pUC katabolit, pTZ, pSK, pBluescript, pGEM vektorokban. Bár a promóter viszonylag gyenge, mégis megfelelő mértékű fehérje kifejeződés érhető el, mivel a plazmid nagy kópiaszámú. Akkor működik a promóter maximálisan, ha a baktérium kultúra médiuma nem tartalmaz glükózt, ugyanis ekkor működik a cAMP/ aktivátor fehérje (CAP), ami szükséges a promóter működéséhez.

Trplac (tac) promóter: hibrid promóter, 35 régió tartalmazza a trp (trp operon) 35 szekvenciáját, majd -10-nél a lavUV5 promoter (lac-operon) szekvenciáját és a lac-operátor szekvenciáját. Így a promóter regulálható a lac-represszorral, azaz a génátírás indukálható IPTG-vel, és független a cAMP regulációtól.

Erős promóter, nagymértékű expresszió érhető el vele. Ilyen promóter található a pGEX vektorokban, amelyek sematikus felépítését a 12.5. ábra mutatja be.

161 12.5. ábra: A pGEX-3X expressziós vektor térképe

A pGEX vektorok replikonja (pMB1) a pBR322 vektorból származik, ezért ezek alacsony kópiaszámú vektorok. Általában ampicillin rezisztenciájuk van, amit a -laktamáz enzim, a rezisztencia gén terméke biztosít. A trp promóterrel való hibridizáció miatt sokkal erősebb indukálható expressziót biztosít, mint a lac promóter, 3-szor erősebb a trp, és 10-szer a lac-promoternél. Ez egy GST-fúziós fehérje termeltetésére alkalmas vektor (ld.12.2.3.1. fejezet)

Trp-lac (trc) promóter: szintén hibrid promóter, a tac promóter egyik változata. A különbség a két promóter között a -35 és -10 elemeket elválasztó távolságban van, a trc-promóternél rövidebb. Ilyen promóter található a pTrc vektorokban.

T7 promóter: A legerősebb promóterek közé tartozik. A T7 bakteriofág specifikus promótere, 5-ször erősebb, mint az E. coli baktérium konszenzus promótere, ezért nagymértékű expressziót biztosít. Speciális baktériumtörzs kell hozzá, amely képes felismerni a T7 promótert, azaz termeli a T7 RNS-polimeráz enzimet (az E. coli RNS-polimeráz enzim csak a saját génjei promótereihez kötődik, miként a T7

bakteriofág RNS-polimeráz csak a fág gének promótereihez kötődik). Ezért az E. coli BL21 baktériumtörzs genomjába fág-fertőzéssel bejuttatták a T7 fág RNS-polimeráz génjét úgy, hogy a lacUV5 promóter

szabályozása alatt legyen. Az így kapott baktériumtörzset hívjuk BL21(DE3)-nak. A DE3 profág egy -fág származék, amelynek - a kromoszomális integrációért felelős int génjébe juttatták be a T7

RNS-polimeráz és a lacI represszor fehérje géneket. Ebben a törzsben a laktóz analóg IPTG hatására beindul a T7 RNS-polimeráz termelése, ami felismeri a plazmidon lévő T7-promótert, és elkezdi átírni a promóter után lévő inszertet.

Ilyen promóter található a pET vektorokban (plasmid for Expression of T7 RNA polymerase) (eredetileg a Novagen biotechnológiai cég terméke), amelyet Studier és társai fejlesztettek ki a ’90-es évek elején. Ezek a vektorok colE1 origót (replikon) tartalmaznak, ami alacsony kópiaszámot biztosít, és általában ampicillin vagy kanamicin rezisztencia gént hordoznak. A promóterük vagy a T7 fág természetes promótere, a φ10 promóter, vagy a természetes φ10 promóter a lac operátorral (LacO) együtt. Az így kapott T7lac promóter már indukálható IPTG-vel, és nagyobb biztonságot jelent, mert mind a polimeráz, mind a termelendő fehérje génje a lac operátor szabályozása alatt áll, és IPTG-vel indukálható. Tehát indukció nélkül elméletileg nincs génátírás. De a BL21 pLysS és pLysE baktériumtörzsekben még egy extra biztosíték is van; ezek a törzsek külön plazmidon (pLys) hordozzák a T7 RNS-polimeráz természetes inhibitorának, a lizozimnek a génjét.

IPTG nélkül, az esetleg keletkező RNS-polimerázt a lizozim gátolja, így biztos nincs átírás. Ezt akkor

162 érdemes kihasználni, ha toxikus a fehérje a baktérium számára, így csak az indukció hatására kezd a fehérje expresszálódni. Nézzük meg a 12.6. ábraán az igen gyakran használt pET-expressziós rendszer működését.

Itt találhatók további elméleti és gyakorlati részletek a legmegfelelőbb vektorok kiválasztásáról.

12.6. ábra: A pET-expressziós rendszer sémája

λpL promóter: Magas hőmérséklettel indukálható, mert hőmérséklet érzékeny represszort tartalmaz. A -fág represszor fehérje alacsony hőmérsékleten a promóterhez kötődik, míg magasabb hőmérsékleten leválik, így elkezdődhet a génátírás. A baktérium kultúrát 30°C-on növesztjük, majd az indukció 42°C-on történik.

Ez a promóter különösen hasznos toxikus fehérjék kifejeztetésénél. Ilyen vektorok a pHUB, pPLc, pKC30, pAS1, pRM1, pTrxFus sorozatok. De ehhez a promóterhez is speciális E. coli törzsre van szükség: az M5219 törzs a -represszor gén hőmérséklet érzékeny mutációját hordozza.

araBAD promóter: Az arabinóz operon operátor helyét tartalmazza, így arabinózzal indukálható, dózis-függő módon. A promóter, mivel arabinóz hasznosítású operon része, glükózzal gátolható. Ilyen promóterrel a pBAD sorozat (Invitrogen) vektorai működnek.

lpp promóter: Az expressziós vektor a kifejezendő gén előtt egy külső membrán lipoprotein promóterét tartalmazza. Ez a fehérje nagy mennyiségben és állandóan kifejeződik a baktérium sejtben, így a promóter erős és konstitutív lesz.

phoA promóter: A bakteriális alkalikus foszfatáz gén (phoa) promóterét és N-terminális leader szekvenciáját tartalmazza. Így a fehérjénk olyan N-terminális szekvenciával fog kifejeződni, ami a

periplazmatikus térbe küldi. A promótert lehet indukálni foszfát megvonással, vagy akár éheztetéssel. Ilyen promóter található a pTA vagy pBAce vektorokban.

rrnB promóter: Magyar vonatkozású promóter; Venetiáner Pál akadémikus és munkatársai (MTA SZBK, Szeged) fejlesztették ki. Azon alapul, hogy a transzkripció mértékéhez nagyban hozzájárulnak a

promóterhez képest upstream irányban lévő szekvenciák is. Ezért az 5S rRNS gén promóteréhez, ami magában is egy nagyon erős promóter, még egy extra 5’-szekvenciát adtak -40-60 régióban. Ez az upstream szekvencia (UP promóter modul) az RNS-polimeráz -alegység C-terminális részének kötőhelyét

tartalmazza, így értelemszerűen megnöveli a génátírás hatékonyságát (kb. 30-szorosára).

12.2.1.2. Riboszóma kötőhely (RBS)

163 Az RBS vagy Shine-Dalgarno szekvencia (amely az átírt mRNS 5’-UTR, azaz nem transzlálódó régiójában található) is nagyon fontos a gének kifejeződéséhez. Ez az 5-9 nukleotidból álló szekvencia komplementer a 16S rRNS 3’ régiójával, így segíti a riboszóma kötést és a transzláció iniciálását. Az RBS és a transzlációt iniciáló ATG (start) kodon távolsága 3-11 nukleotid, s szintén jelentősen befolyásolja az expresszió mértékét (azaz a távolság változtatásával is optimalizálni lehet a fehérjetermelés szintjét – ld. később). Az expresszió hatékonyságát a RBS-től még távolabb lévő 5’-nem kódoló régiók is befolyásolják és a gén 3’-végén található transzkripció terminciós szekvenciák is növelhetik (bár nem esszenciálisak a legtöbb rekombináns fehérje előállításához).

A kereskedelemben kapható expressziós vektorok tartalmazzák a megfelelő szabályozó elemeket. Nekünk csak arra kell ügyelnünk, hogy az expresszálandó génünket a megfelelő helyre klónozzuk be; a promóter és a riboszóma kötőhely után, ne vágjuk ki a riboszóma-kötőhelyet, és a leolvasási keret se tolódjon el. A START kodont tartalmazhatja a vektor szekvencia (pl. az NdeI restrikciós enzim felismerőhelyében van egy START kodon: ATGCAT), de a cDNS-sel is bevihetjük a vektorba, csak az RBS-hez való távolságára kell ügyelni. A promóter és a riboszóma-kötőhely létfontosságúak a gének expessziójához, a szabályozó elem (operátor régió) nélkül ugyan működhet az expressziós rendszer, de mégis ajánlott erre is gondolnunk, főleg az expresszió optimalizálásához (ld. alább). A kiválasztott expressziós rendszer vektorai tartalmazzák ezeket az elemeket. Azt kell még meggondolnunk, hogy a kívánt fehérje utolsó aminosava után szeretnénk-e befejezni a fehérje szintézisét, vagy fúziós címkét akarunk a fehérje C-terminális részére. Első esetben STOP kodont kell tennünk a cDNS végére (természetesen használhatjuk a gén saját STOP szekvenciáját is), a második esetben ki kell ezt hagyni. Ezután csak az MCS (multiklónozó hely) megfelelő helyére kell bevinnünk az expresszálandó gén cDNS-ét. Az így elkészített vektort be kell juttatnunk a megfelelő gazdasejtbe (ld. 4.3. fejezet).