Rekombináns fehérjék termelése és izolálása

Ha optimalizáltuk fehérjénk expresszióját, és tudjuk azt is, hogy a sejt mely részéből kell tovább

tisztítanunk, akkor elkezdhetjük a nagyobb mennyiségű fehérje termelését célzó, nagy léptékű expresszió végrehajtását, amely a következő alfejezetekben ismertetett lépésekből áll.

12.2.4.1. Indító (starter) kultúra elkészítése

Az elkészült rekombináns DNS konstrukciót transzformáljuk a megfelelő expressziós törzsbe (pl.

BL21(DE3)). A transzformátumot megfelelő antibiotikumot tartalmazó szilárd táptalajra szélesztjük és 37ºC-on inkubáljuk. Másnap egy jól körülhatárolt telepet antibiotikumot tartalmazó 50 ml LB-tápba oltunk . Ez lesz a starter kultúra, amit 37ºC-on rázatás mellett növesztünk. 12-16 óra múlva, a starter kultúra

megfelelően felszaporodik.10-20 ml-ét 1l megfelelő antibiotikumot tartalmazó folyékony táptalajba oltjuk, amivel elindítjuk az expressziós kultúránk növesztését. A megfelelő expressziós klón folyadékkultúrában felnövesztett szuszpenziója 10% glicerinnel (amely ez esetben a fagyálló szerepét ötli be) elkeverve lefagyasztható és 80°C-on hosszú ideig tárolható. Ilyen glicerines expressziós klóntár létrehozásával kiválthatjuk a gyakran használt klónok expressziós sejtbe való transzformálását, elég a fagyasztott kultúra töredék részét szilárd táptalajra inokulálni.

12.2.4.2. Az expressziós kultúra növesztése és indukciója

A megfelelően inokulált (ld. 12.2.4.1.) baktérium tenyészetet 37°C-on, folyamatos rázatás (140-200 rpm) mellett inkubáljuk. Egy rázóinkubátort a 12.8. ábraán mutatunk be. Inkubáció közben nyomon követjük az osztódó baktériumtenyészet sűrűségét. A tenyészet sűrűsége jelzi az osztódások előrehaladását, a

baktériumpopuláció szaporodását és egyszerűen, az optikai denzitás 600 nm-en való mérésével,

spektrofotométeren mérhető. OD600 nm = 0,8 körüli értéknél a baktériumkultúra készen áll az indukcióra. Ha szükséges, hűtsük le az indukció hőmérsékletére és vegyünk belőle mintát a későbbi SDS-gélfuttatáshoz. Ez lesz az indukció előtti minta. Ha a termosztátunk hőmérséklete elérte az indukcióhoz szükséges értéket tegyük bele a megfelelő mennyiségű induktort, ami a leggyakrabban IPTG. Inkubáljuk és rázassuk a megfelelő ideig, majd vegyünk belőle mintát. Ez lesz az indukció utáni minta. Az expressziós kultúrából a következő lépesek során tisztítjuk a termelt rekombináns fehérjét.

172 12.8. ábra: Rázató inkubátor prokarióta és eukarióta szuszpenziós kultúrához

12.2.4.3. A sejtek összegyűjtése (harvesting)

Ahhoz, hogy a sejtekből a fehérjét a megfelelő tisztítási lépésekkel izoláljuk, először össze kell gyűjtenünk a sejteket a táptalajból. Ez a lépés centrifugálással történik (5000 g x 10 min, 4°C-on). A tisztítás során mindig jégben, vagy 4°C-on dolgozunk, hogy ne degradálódjon a fehérje. A sejteket meg kell tisztítanunk a

táptalajtól, amit legtöbbször egy pufferrel (pl. PBS) való mosással végzünk. A sejteket ezután újra centrifugálással gyűjtjük össze.

12.2.4.4. A sejtek feltárása

Az összegyűjtött sejteket lizálva a sejtben levő fehérje kinyerhető. A lízist a sejtek lízis pufferben való inkubálásával végezzük. 1g baktérium sejtre általában 3-4 ml lízis puffert számolunk.

A lízis puffer összetétele:

 Megfelelő pH-t biztosító puffer (általában 7-9 pH-tartományban): pl. 20 mM TRIS, foszfát puffer.

 Só, ami ionerősséget biztosít, általában NaCl, 0,15-0,5 M.

 Detergens, ami segíti a sejtek feltárását, illetve a fehérjék oldatban tartását és csökkenti az aspecifikus kölcsönhatásokat, pl. 0,1-0,2% Tween20, CHAPs, TritonX 100.

 Glicerin 5-10%-ban, ami stabilizálja a fehérjéket.

 Redukálószer, a nem megfelelő diszulfidhidak redukálásához: 2-10 mM béta-merkaptoetanol (a DTT-re és DTE-DTT-re vigyázni kell fém-affinitás kromatográfia esetén).

 Proteáz gátlók, a sejtek degradálódásának kivédésére: pl. 1 mM PMSF, 1-5 mM benzamidin.

A lízist segíti, ha többszörös fagyasztást-felolvasztást alkalmazunk, és/vagy ha a felszuszpendált

sejtkultúrához lizozimot adunk. A lizozim képes a baktériumok sejtfalát bontani és ezért alkalmas a lízisre.

Nagyon hatásos a Gram-pozitív baktériumoknál, de a Gram-negatív baktériumoknál is hasznos, ha detergenssel, vagy ozmotikus sokkal együtt alkalmazzuk. Szonikálással (a sejtek ultrahang segítségével történő feltárásával) is segíthetjük a sejtek lízisét, és a benne lévő DNS darabolását. Vigyázzunk azonban, mert szonikálás hatására melegszik az oldat, ami a preparátumban lévő proteázok aktivitásának növekedését, így a fehérjénk degradálódását okozhatja, és emellett a fehérjénk denaturációjához vezethet. Ezért ezt a folyamatot jégben és szünetekkel végezzük (1 perc szonikálás meghatározott frekvenciával, majd egy perc szünet). Ezt a lépést ismételjük 3-4-szer, míg a preparátum hígan folyóssá nem válik. Ezután DN-áz I

173 enzimmel kezeljük, ami a DNS-t kisebb darabokra vágja. A sejtek feltárását végezhetjük erős detergenssel (TritonX 100 1-2%), deoxikólsavval vagy az ún. French-Press készülékkel is (ez utóbbiban a nagy nyomás tárja fel a sejteket). A feltárás után centrifugálással elválasztjuk az oldható és az oldhatatlan frakciót. A felülúszó a lízispufferben oldódó fehérjéket, komponenseket, míg az oldhatatlan frakció (csapadék) a sejttörmeléket és az inklúziós testet tartalmazza. A további lépések attól függenek, hogy hol található a fehérjénk; a felülúszóban oldható formában, inklúziós testben oldhatatlan formában, vagy a periplazmás térben.

12.2.4.5. Izolálás oldható frakcióból

Ha a fehérjénk az oldható frakcióban van jelen, feltehetően natív formában, akkor ezt a protokollt kell követnünk. A baktérium lizátumban számos fehérje van, köztük proteázok is, amelyek emészthetik a rekombináns fehérjénket. A tisztítás során ezeket el kell választanunk. A sejtek összegyűjtése után a felülúszót visszük tovább, és a címkének megfelelő affinitás kromatográfiás tisztítási lépés következik.

Amennyiben a fehérjénk tartalmaz polihisztidin címkét, ezt a legcélszerűbb alkalmazni, mert nagy affinitású és denaturáló körülmények között is működik.

12.2.4.6. Preparálás zárványtestből (inclusion body)

Ha a fehérjénk nem az oldható fázisban, hanem a csapadékban van jelen, akkor fel kell oldanunk, amire számos lehetőség kínálkozik: 5-8 M guanidin-HCl, 6-8 M urea, SDS-oldat, lúgos pH. A csapadékot először mossuk 1-2% Triton X 100 oldattal, majd centrifugáljuk. A mosott csapadékot szolubilizáló oldatban (5-8 M guanidin-HCl vagy 6-8 M urea) vesszük fel. A csapadékot fel-le pipettázással oldjuk, és 4ºC-on több órán át állni hagyjuk. Inkubálás után tisztítás céljából ismét lecentrifugáljuk az oldatot, de most már a felülúszó tartalmazza a feloldott fehérjénket, igaz a denaturálószerben. Választhatunk, hogy elvégezzük denaturáló körülmények között a fém-affinitás kromatográfiát, vagy megpróbáljuk renaturálni a fehérjét, és utána alkalmazzuk a tisztítási lépést. Legcélravezetőbb az először alkalmazott fém-affinitás kromatográfia, hisz ez, mint már említettük, denaturáló körülmények között is jól működik, feltétele viszont, hogy a fehérjénk tartalmazzon His-címkét. A gyantára felkötött és mosott fehérjét vagy olyan elúciós pufferrel eluáljuk, ami még tartalmazza a denaturálószert, vagy lecseréljük a mosó-eluáló puffert denaturálószer nélküli pufferre.

Amennyiben az elúciós puffer is tartalmaz denaturálószert, akkor meg kell szabadulni tőle, hogy a fehérjénk renaturálódni tudjon. Erre legjobb módszer a dialízis. Ez történhet lépésenként, azaz fokozatosan

csökkentjük a dializáló pufferben a denaturálószer koncentrációját, és közben emeljük a NaCl mennyiségét, hogy ne aggregálódjon a fehérje. A dialízis során a fehérje visszanyeri a szerkezetét, és remélhetőleg a biológiai aktivitását is. Ezt persze függ a fehérjétől, minél több doménből áll egy fehérje, annál

reménytelenebb a renaturáció. Szintén reménytelen a renaturáció, ha a fehérjénk feltekeredéséhez az eredeti sejtkörnyezetben dajkafehérjékre van szükség. A dialízis során a ciszteint tartalmazó fehérjéknél

mindenképpen alkalmazzunk redukálószert: DTE, DTT, béta-merkaptoetanol, TCEP (Trisz-karboximetil-foszfin). Ennél a módszernél nagyon fontos, hogy a fehérje elég jól renaturálódjon, és visszanyerje biológiai aktivitását. Előnye viszont, hogy nagy tisztaságú és általában nagy mennyiségű fehérjét lehet előállítani. Az inklúziós test nagyon kevés egyéb fehérjét (és így proteázt) tartalmaz, a rekombináns fehérjénk akár az összefehérje 90%-a is lehet.

12.2.4.7. Izolálás periplazmából

A periplazmás tér a Gram-negatív baktériumok külső és belső membránja közötti tér. Itt jobb lehetőségek kínálkoznak a megfelelő foldingra és a diszulfidhíd képződésre. Ide megfelelő N-terminális szignál szekvenciát tartalmazó fehérjék jutnak el. Ilyen szekvencia az ompA, pelB, vagy a phoa-fúziós fehérjék.

Ilyenkor a tisztításhoz használt címkét a C-terminálisra kell tenni.

A sejt feltárása enyhébb körülmények között, nem szonikálással, hanem ozmotikus sokkal történik. A

174 sejteket 80 ml puffer/1 g sejtcsapadék mennyiségű lízis pufferben kell felvenni, amely tartalmaz 20%

szacharózt is. Az izoozmotikus oldatban lévő sejteket centrifugáljuk (8000 g x 20 min, 4ºC), majd

szuszpendáljuk őket nagy mennyiségű 5 mM MgCl2 oldatban, végül újabb centrifugálás következik. Az így biztosított hipoozmotikus körülmények között a periplazmás fehérjék már a felülúszóba kerülnek.

Másik bevált módszer, hogy az összegyűjtött sejteket rögtön a MgCl2 oldatban vesszük fel, ami

hipoozmotikus sokk a sejtnek, és óvatosan lefagyasztjuk 20ºC-on, majd óvatosan felengedjük. Ilyenkor a sejt külső membránja megsérül, de a belső épen marad. Így centrifugálással elválaszthatjuk a sejteket, míg a felülúszóban marad a periplazmatikus tér tartalma.