Hibridizációs technikák és nukleinsav próbák

A molekuláris biológiában a hibridizációs technikákkal valamilyen ismeretlen biológiai mintából akarunk kimutatni egy adott DNS, RNS vagy fehérje szakaszt. Meg akarunk bizonyosodni annak jelenlétéről, mennyiségéről, minőségéről. A hibridizációs technikáknak köszönhetően nincs szükség feltétlenül

szekvenálásra, ha a genomban egy mutációt vagy strukturális változást akarunk azonosítani. A hibridizációs technikák molekuláris hátterét az a tény adja, hogy a DNS két komplementer szála reverzibilis módon denaturálható, s a renaturáció nem csak a két eredeti szál között megy végbe, hanem egy oligonukleotid próba jelenlétében az is anellál (hozzátapad) a vele komplementer szálhoz.

Ezekhez az eljárásokhoz tehát mindig szükséges valamilyen ismert szekvenciájú DNS vagy RNS próbára.

Próbának nevezzük a radioaktívan vagy más módon (leginkább fluoreszcenciával) jelölt (az esetek többségében oligonukleotid méretű) oligo- vagy polinukleotidot, ami komplementer a vizsgálni kívánt nukleinsav egyik láncának szekvenciájával. Az egyszálú próba csak egyszálú cél nukleinsav lánchoz képes kapcsolódni. A hibridizáció „szigorúsága” (stringency) attól függ, hogy milyen só koncentrációt és hőmérsékletet alkalmazunk. Magas anellációs hőmérsékleten és alacsony ionerő ún. szigorú (stringent) körülményeket jelent, ilyen esetben csak a próbával tökéletesen egyező nukleotid szálak fognak hibridizálni.

Azonban magas ionerőn és alacsonyabb hőmérsékleten a csak részben hasonló szekvenciákhoz is hozzátapadhat a próba.

A fejezet első részében a próbakészítés és jelölés lehetőségeit vázoljuk fel, a további alfejezetekben a Southern- és Northern-lenyomat (blot) módszerről, az in situ hibridizációról és a DNS chipekről lesz szó. Néhány további hibridizációs módszert (pl. kolónia- vagy plakk-hibridizáció) az azt alkalmazó módszert leíró fejezetben tárgyalunk (ld. 8. fejezet). (A hibridizációról még ld. 18.1. animáció:

Hibridizáció.)

4.1.3.1. Nukleinsav próbák előállítása és jelölése

Korábban szinte kizárólag izotópjelölést használtak. A jelölt molekula a próbakészítés módszerétől függően (ld. alább) lehet -ATP, -ATP, -CTP. Az izotópot tekintve használhatunk ³²P-t (felezési idő =14 nap),

33P-t (t½=25 nap), ³⁵S-t (t½=87 nap). A hibridizálás eredményét radioaktív próba esetén autoradiográfiával tesszük láthatóvá. Később megjelentek egyéb jelölési módok is, amelyek között a radioaktivitással azonos érzékenységű fluoreszcens próbák terjedtek el leginkább. A fluoreszcens próbákról részletesebben a szekvenálás (ld. 5. fejezet) és a PCR fejezetben (ld. 6.3.2. fejezet) lesz szó. A radiokatív és nem-fluoreszcens próbák között megemlítjük a digoxigenint, egy erősen immunogén (ami azt jelenti, hogy igen nagy affinitással hozzákötődő antitestek állnak rendelkezésünkre), növényi eredetű szteroid, ami

nukleotidokra konjugálható, s beépíthető nukleinsav próbákba (az előhívás az antitest jelölésével vagy a hozzá konjugált enzim által termékként előállított festékkel vagy kemiluminszcenciával történhet).

Az oligonukleotid próbákat szilárdfázisú szintézissel (szintetizátorokban), míg a hosszabb DNS vagy RNS próbákat enzimatikus úton állítunk elő. Az egyik lehetőség a DNS molekula végjelölése. Az 5’-végjelöléséhez két enzimre van szükség. Alkalikus foszfatázzal eltávolítjuk a foszfát-csoportot, majd polinukleotid-kináz segítségével ATP-ből izotóp jelölt foszfát-csoport (-foszfát jelölt!) építhető be a DNS 5’-végére. A 3’-végjelöléshez a DNS-polimerázok 3’5’ exonukleáz aktivitását használjuk ki. A

„visszarágott” szálhoz a polimeráz aktivitás révén dNTP-ből izotóp vagy fluoreszcens jel épül be a 3’-vég közelébe. Ebben az esetben általában jelölt dCTP-t használnak (ennél a módszernél az α-foszfátot kell jelölni!). Készíthetnünk enzimatikusan random DNS próbákat úgy is, hogy DNS-polimeráz segítségével

47 dCTP-ből épül be a jel az újonnan szintetizált láncba. Ugyanezen az elven RNS-polimerázzal

DNS-templátról jelölt RNS-próbák is előállíthatók in vitro transzkripcióval.

Megjegyzendő, hogy léteznek szintetikus ún. peptid-nukleinsav (PNA) próbák is, amelyekben a

cukorfoszfát gerinc és a foszfodiészter kötések helyett poli N-(2-aminoetil)-glicin váz található és a bázisok ehhez metilén-karbonil csoporton keresztül kapcsolódnak (a bázisok távolsága megegyezik a

foszfátgerinchez kapcsolódó bázisok távolságával, tehát a PNA is tud bázispárosodni egy komplementer lánccal). Egy PNA részletét a 4.10. ábra mutatja be.

4.10. ábra: Egy peptid-nukleinsav részlete

4.1.3.2. Southern-blot (lenyomat) technika és az RFLP módszer

A Southern-blot (magyarul lenyomat) technika speciális DNS szakaszok kimutatására szolgál egy komplex DNS mintában. Például egy adott gén jelenlétét tudjuk vizsgálni különböző fajok teljes genomjában. Ezzel a technikával a gén méret vagy szerkezetbeli megváltozása is kimutatható. A

„lenyomatra” azért van szükségünk, mivel a gélből a DNS diffúzióval az oldatba kerülne a hibridizálás során, másrészt a gél törékeny és nehezen kezelhető.

A Southern-blot kivitelezésekor először a nagyobb méretű DNS molekulát, akár egy teljes genomot, restrikciós endonukleázokkal kisebb darabokra hasítunk, majd agaróz gélben futtatjuk a mintát. A hibridizáció miatt egyszálú DNS molekulákra van szükségünk, ezért NaOH segítségével denaturáljuk a kettős szálat, majd K-acetáttal semlegesítjük. A gélt elektrolit oldatba helyezzük (ami lehet egy szivacs, vagy a blottoló folyadékkal átitatott szűrőpapír), és a tetejére simítjuk a nitrocellulóz- vagy

nylonmembránt. A membrán fölé további nedvszívó anyagot (pl. szűrőpapír) rétegezünk. A kapillárishatás miatt a DNS-molekulák a gélből a membránba vándorolnak. A membrán csak az egyszálú DNS-eket köti meg ugyanabban a pozícióban, ahogyan azok eredetileg a gélben elhelyezkedtek (ld. 4.11. ábra). A nitrocellulóz membrán esetében száraz hőkezeléssel (60-100°C-os vákuumban), a nylonmembrán esetében pedig UV-kezeléssel kovalensen hozzákötjük a DNS-t a membránhoz. Ezt követi a hibridizációs próbával történő inkubálás. Majd a membránról lemossuk a nem kötődött nukleinsav próbákat és röntgenfilmen autoradiográfiával, fluorométerrel vagy fotométerrel detektáljuk a jelet (a próba jelölésétől függően).

Radioaktív próba esetén előhíváskor a membránra egyszerűen egy röntgenfilmet helyezünk, és ahol a próba hozzákötődött a mintához, elfeketedik a film. Ezek a sötét sávok tökéletesen egybeesnek a hibridizált, azaz azonosítani kívánt DNS sávjával. Ma már elterjedtek az olyan eljárások is (az ún. foszfo-image screen), ahol a radioaktív jelet közvetlenül digitális jellé lehet alakítani. A radioaktivitás használata a sugárzás

veszélyessége miatt ma már kevésbé használatos. A detektálás történhet még kolorimetriával, amikor a

48 próbán valamilyen festékanyag található, amely enzim (pl. alkalikus foszfatáz, peroxidáz) jelenlétében oldhatatlan színes csapadékká alakul, és megfesti a membránt. Ez szabad szemmel is jól látható. Egy másik nem izotópos detektálási mód a fluoreszcens kimutatás, amikor biotinált próbát alkalmazunk, és a

membránt fluoreszcens reagenssel jelölt avidinnel vagy sztreptavidinnel kezeljük, majd fluorimetriával detektáljuk. Manapság jóval elterjedtebb és közkedveltebb a kemilumineszcencián alapuló előhívás (ECL:

Enhanced Chemiluminescence: megnövelt kemilumineszcencia). Ennél a módszernél a próbára kovalensen valamilyen enzimet, általában torma-peroxidázt konjugálnak. Ezután a membránt olyan anyaggal kezeljük, ami a torma-peroxidáz szubsztrátját, leggyakrabban luminolt tartalmaz. Az oxidáció során, hidrogén-peroxid jelenlétében, a luminol gerjesztett állapotba kerül, és egy fotont bocsát ki, amit megfelelő detektorral vagy röntgenfilmen azonosíthatunk. Fenol vázzal rendelkező molekulák jelenlétében a fénykibocsátás akár 1000-szeresére is növelhető. Ettől lesz „megnövelt” kemilumineszcencia az eljárás.

4.11. ábra: Southern-blot (lenyomat) technika. A gélben lévő DNS-t nitrocellulóz vagy nylon membránra transzferáljuk, így az elválasztott DNS mintázatának replikáját kapjuk. A transzfer általában egy szivacson keresztül

történik, amit egy puffer tartályba helyezünk. A gélt és a membránt a szivacsra tesszük, fölé pedig vastag rétegben szűrőpapírt helyezünk, hogy felszívja a puffert a szivacson, gélen és membránon keresztül. Ezáltal a DNS a gélből a

membránba vándorol, és erősen immobilizálódik.

Southern-blot technika segítségével analizáljuk az RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism:

restrikciós fragmentum hossz polimorfizmus) módszer alkalmazása során kapott DNS fragmentumokat is. Az RFLP módszer lényege, hogy homológ DNS molekulák variációira (SNP: single nucleotide

polymorphism, kiejtve „sznip”) világíthat rá. Az eljárás során teljes genomból indulunk ki, melyet restrikciós endonukleázokkal kezelünk. Az különböző endonukleázok (ld. 3.2.1.2. fejezet) eltérő DNS szakaszokat ismernek fel. Az endonukleázos kezelés után kapott DNS fragmentumok száma az enzim által felismert szekvenciák számától, mérete pedig ezek távolságától függ. A restrikciós fragmentumokat ezt követően gélelektroforézissel szeparáljuk, és Southern-blot hibridizációval detektáljuk. RFLP abban az esetben jelenik meg, ha a vizsgált DNS szálon található inszerció, deléció vagy SNP egy meglévő restrikciós helyet tönkretesz vagy egy újat hoz létre. Ilyenkor gélelektroforézissel eltérő hosszúságú DNS fragmentumokat kapunk. Az RFLP analízis volt az első DNS „ujjlenyomatot” feltérképező, széles körűen elterjedt technika (DNA profiling, DNS tipizálás), amelyet bevezettek az igazságügyi orvostani és a bírósági gyakorlatba is.

Az RFLP technika nagyon fontos eszköz volt a genomok fizikai feltérképezésében, különböző mutációk kimutatásában. Ezzel a módszerrel különböző betegségek, vagy az azokra való hajlam is kimutatható.

A 4.12. ábran egy bűntény elkövetőjének Southern-blot módszerrel előállított RFLP mintázat alapján történő azonosítását mutatjuk be. Ezt az alkalmazást Alec Jeffrey vezette be a gyakorlatba az 1980-as évek közepén (a szexuális-indíttatású gyilkosság elkövetőjét a bíróság a DNS ujjlenyomat alapján 1992-ben életfogytiglani börtönbüntetésre ítélte – ez volt a bírósági gyakorlatban az első eset, ahol géntechnológiai bizonyíték alapján született meg az ítélet).

49 4.12. ábra: RFLP, mint DNS ujjlenyomat előállítása. Az eljárás során az egyénekből vett DNS mintát restrikciós endonukleázokkal emésztik, gélelektroforézissel elválasztják, majd Southern-blot hibridizálással állítják elő a DNS

ujjlenyomatot, amellyel akár egy bűntény elkövetőjét is azonosítani lehet (ld. a bemutatott ábrát).

4.1.3.3. Northern-blot

A Southern-blottal rokon technika a Northern-blot, csak ebben az esetben DNS helyett RNS molekulákat analizálunk. Ez az eljárás jóval nagyobb elővigyázatosságot igényel, mivel az RNS rendkívül bomlékony.

Ezért minden oldatot és eszközt RN-áz mentesíteni kell. Segítségével megállapítható egy adott sejt pillanatnyi génexpressziós állapota és annak változása például differenciálódás során vagy patológiás esetekben. Az izolált mRNS mintát agaróz gélen választjuk el, de a gél formaldehidet vagy glioxált is tartalmaz, amelyek denaturálják az RNS-t, megszüntetik az esetleges másodlagos szerkezeti elemeit. Kisebb méretű RNS molekulák esetén (pl. siRNS, miRNS) ureát tartalmazó poliakrilamid gélt alkalmaznak a tökéletesebb elválasztás érdekében. Az így elválasztott RNS-t tartalmazó gélt nylon membránra blottolják a Southern-blothoz hasonló módon. A blottolás után az RNS membránhoz rögzítését UV keresztkötéssel végzik. A hibridizáció körülményeit a kimutatandó RNS, a használt próba (végjelölt oligonukleotid, random jelölt DNS vagy RNS próba) és a használt hibridizációs puffer együttesen határozzák meg. A kapott jelet a Southern blottnál leírtakhoz hasonlóan hívhatjuk elő. A használt radioaktív próba megfelelő körülmények között (alacsony sókoncentráció, magas hőmérséklet) a membránról lemosható. Az így „lefőzött” membrán RNS-eket detektáló új radioaktív próbával újrahibridizálható.

4.1.3.4. In situ hibridizáció, kariotipizálás

Az in situ hibridizációs eljárás során, sejten, szöveten belül tudunk komplementer nukleotid szakaszokat hibridizáltatni jelölt próbákkal. Az in situ DNS hibridizálás általában a kromoszóma struktúrák

megfigyelésére használatos módszer, míg az in situ RNS hibridizálással az adott szövetben expresszáló mRNS-eket, illetve miRNS-eket tudjuk kimutatni mikroszkopikus metszeteken Az egyik legelterjedtebb változata ennek a technikának a fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH), amellyel a genom egy-egy

50 kisebb szakaszát lehet megjeleníteni. A FISH technikák fejlődésével, nagy pontossággal és biztonsággal lehet citogenetikai diagnózisokat felállítani, tumoros sejteket azonosítani. A különböző méretű és típusú DNS szakaszok kimutatásához többféle próba áll rendelkezésre. A próbákat egy hapténnel (pl. biotin, digoxigenin, ösztradiol) jelölik, amelyhez különböző fluorokrómok (pl. FITC, rodamin) kapcsolódnak.

Teljes hosszúságú kromoszómák kimutatásához az ún. painting próbák alkalmasak. Ha a próbákat eltérő színű fluorokrómmal jelölik, akkor a különböző kromoszómák más-más színnel fognak világítani. Az ún.

mulitplex-FISH (M-FISH) technikával egyidejűleg jelölhető az összes kromoszóma (ld. 4.13. ábra), és ezáltal sokféle DNS átrendeződés közvetlenül kimutathatóvá válik.

4.13. ábra: Multiplex-FISH. A humán kromoszómákat különböző fluoreszcens festékkel jelölték (forrás:

JackeyCheng.com)

A kromoszómák telomer és centromer régióiban egy adott kromoszómára jellemező ismétlődő szakaszok találhatók, így ezekre a szekvenciákra találták ki a repetitív próbákat. Ezek a próbák főként a kromoszómák számbeli eltéréseinek kimutatására alkalmasak. A génspecifikus és töréspont-specifikus próbákkal speciális, rövidebb szakaszok jelenlétét, hiányát vagy struktúráját lehet feltérképezni. A FISH-sel előállított jel

mikroszkópban is megfigyelhető. Azonban a detektálás legérzékenyebb módja ún. CCD kamerákkal történik. Ez a kamera -20°C-on olyan fluoreszcens jeleket is érzékel, amelyre az emberi szem már nem képes. A FISH felbontási képessége 50 kbp-tól 2 Mbp-ig terjed, a DNS kondenzáltságától függően. (A FISH módszerről még ld. 18.2. animáció.)

4.1.3.5. DNS-chip (microarray) technika

A hibridizációs technikák legújabb változata a DNS-chip vagy microarray. Egy kis méretű (1-2 cm²) szilárd hordozó (pl. szilikon, üveg) felületére szabályos elrendezésben több 10000, eltérő szekvenciájú DNS próbát rögzítenek kovalensen. Ez történhet pl. epoxi- vagy amino szilánnal, de gyakoribb a

fotolitográfiás eljárással történő in situ szintézis (oligonukleotid próbák esetén). A chipen 1 pont kb. 1 pmól mennyiségű DNS-t tartalmaz. A próbák 20-5000 nukleotid hosszúságúak, génekre vagy cDNS-ekre

specifikus oligonukleotidok vagy in vitro szintetizált DNS-fragmentumok. Az eljárás lényege, hogy

mikroszkóp segítségével detektáljuk azokat a próbákat a chipen, amelyekkel komplementer DNS vagy RNS van jelen a mintában. A klasszikus, az előző alfejezetekben ismertetett hibridizációs módszerekhez képest a chip technológiánál megfordult a próba és a minta viszonya: itt a próbát, míg az előző módszereknél a mintát immobilizálják (blottolással).

A chipekhez használatos cDNS minták általában úgy készülnek, hogy a vizsgálni kívánt szövetet vagy sejtkultúrát feltárják, és kivonják az mRNS-t, amiből reverz transzkriptázzal cDNS-t szintetizálnak. Ez a mennyiségű cDNS azonban nagyon kevés lenne a további munkákhoz. Ezért PCR reakcióval, fluoreszcens módon jelölt primerek segítségével (pl. Cy5: vörös; Cy3: zöld) sokszorosítják a target DNS szálakat, majd ezt a cDNS-t tartalmazó oldatot inkubálják a chipen. A nem kötődött DNS darabokat lemossák, és a chipet általában egy speciális fluoreszcens előhívó készülékkel (chip reader) vizsgálják. A chip pontjai által

51 kibocsátott fény színét és intenzitását detektálják. A kapott képet számítógépes programok segítségével elemezik; összehasonlítják a különböző minták hibridizációs értékeit, így egy adott kezelésre történő

expressziós változásokhoz olyan számok rendelhetőek, melyek a relatív expressziót fejezik ki. A kiértékelés részleteire ebben a jegyzetben nem térünk ki.

A DNS microarray módszert széleskörűen alkalmazzák a funkcionális genomikában; génexpressziós változásokat, valamint az SNP-ktől kezdve a teljes genomot átfogó genetikai különbségeket lehet a módszerrel analizálni. További érdekességeket a módszer alkalmazásáról itt olvashatnak. . (A DNS microarray-ről még ld. 18.3. animáció.)

Egy gén-chipet és egy expressziós összehasonlító vizsgálat sémáját a 4.14. ábra mutatja be.

4.14. ábra: Gén-chip (az Affimetryx biotechnológiai cég terméke). A bemutatott két chip-en egyidejűleg több mint 40.000 humán (bal) és egér (jobb) transzkriptumot lehet analizálni. Az mRNS-eket a chip-en in situ fotolitográfiával szintetizált specifikus komplementer DNS próbák reprezentálják (bal) (forrás: Wikipedia, GNU Free Documentation

License). Összehasonlító génexpressziós vizsgálat (rákos és egészséges sejt) hibridizációs chipen (jobb)