PCR az alkalmazott kutatásban

Napjainkra a PCR-rel számos alkalmazott tudományágban értek el átütő sikereket. Az orvosi

diagnosztikában, az igazságügyi orvostanban ma már alapmódszerré vált, de érdekes módon a régészet, sőt az őslénytan is alkalmazza (amennyiben a kérdéses mintában DNS-t vagy legalábbis nukleinsav töredéket lehet detektálni). Ezen kívül használják a mezőgazdaságban, az élelmiszeriparban is. A következőkben röviden áttekintjük a PCR szerepét az alkalmazott tudományokban.

6.5.1. Orvosi diagnosztika

Az orvosi diagnosztikában egyes betegségek kimutatása a diagnosztikához használt módszer

érzékenységétől függ. Minél érzékenyebb az eljárás, annál hamarabb meg lehet kezdeni a szükséges

83 beavatkozást, valamint jobban elkerülhetőek a hibás negatív eredmények (igaz, hogy a fals pozitív esetek száma növekedhet). Vírusfertőzéseknél, mint például a HIV, a vírusos hepatitisz, különösen fontos a PCR-rel történő érzékeny diagnosztika használata. Tumorok vizsgálatára a valós-idejű kvantitatív reverz

transzkripciós PCR a megfelelő eszköz. A rákos sejtek vagy a vírusfertőzések transzkriptumaik alapján kimutathatóak.

Az onkológiai diagnosztikában a génátrendeződések következtében megjelenő fúziós mRNS termékek kimutatására is használnak PCR-t. Akut mieloid leukémiára utal például az AML1–ETO fúziós

transzkriptum megjelenése. A gyógyult betegeknél különösen fontos kimutatni a minimális reziduális betegséget (MRD), a kis mennyiségű visszaeséshez vezető maradék rosszindulatú sejtet. PCR-rel az AML1–

ETO fúziós transzkriptum mennyisége pontosan megbecsülhető. Az MRD megállapítása alapulhat még klonális tumor markereken, kromoszomális transzlokációs markereken és egyéb, újonnan létrejött fúziós transzkriptumokon. A valós-idejű PCR technikák használatával a felsorolt markereket vizsgálva életbevágó előrejelzések születhetnek. A telomeráz aktivitás a tumorok 85%-ban kimutatható, míg az egészséges szövetekben általában jóval alacsonyabb mértékben vagy egyáltalán nem fordul elő, így több rákos megbetegedésnél is ígéretes diagnosztikai marker lehet a PCR-rel történő kimutatásuk. Hasnyálmirigyrák vizsgálatánál a hasnyálmirigy nedvben mérve is sikerült valósidejű idejű PCR-rel a telomeráz hTERT alegység mRNS-ének szintjét mérni. A kutatásban a kimutatott hTERT mRNS szintje korrelált a hasnyálmirigyrák megjelenésével. Sok más példát is fel lehetne még sorolni a PCR tumordiganosztikai alkalmazásáról.

6.5.2. Igazságügyi orvostan (DNS „ujjlenyomat”)

Az igazságügyi orvostanban (forensic science) komoly fejlődést eredményezett a DNS profilok megjelenése.

A humán genomban több tízezer rövid, tandem ismétlődő (STR: Short Tandem Repeat)) szekvencia található, amelyek személyenként eltérőek. Napjainkban a DNS ujjlenyomat készítésére főképp az STR szekvenciákat vizsgálják PCR segítségével. Az eljárás során multiplex, azaz egyszerre több,

lókusz-specifikus primer párt használva amplifikálják az STR szekvenciákat, s az így kapott, (általában kapilláris) elektroforézissel kimutatható, eltérő hosszúságú fragmentumok képezik az azonosítás tárgyát. Az USA-ban és Európában bizonyos eltérések vannak a vizsgált STR lókuszok használatában. Az azonos DNS

ujjlenyomatok elkerülésének érdekében a ’90-es években használt STR lókuszok számához képest mára jóval többet, akár 16 STR lókuszt is amplifikálnak egyszerre. A DNS ujjlenyomat használatával apasági tesztet is végezhetünk, amennyiben a gyerek apjának személye kérdéses. Rokonsági viszonyok feltárása is lehetséges PCR analízis (DNS profil) segítségével. Hogy csak egy példát említsünk: néhány évvel ezelőtt ezzel a módszerrel azonosították a Jekatyerinburgban 1918-ben lemészárolt Romanov orosz cári család földi maradványait.

6.5.3. „Ős”-PCR

Az ősidők kutatóinak is nagy segítséget nyújt a PCR módszer. Egyrészt a paleontológiai vizsgálatoknál az ősmaradványokból kinyert DNS felsokszorosításával és további módszerek alkalmazásával pontosabb információkat nyerhetünk az adott élőlény taxonómiai azonosításához, és ezzel evolúciós léptékben is tisztább képet kaphatunk az adott őstörténeti kor bioszférájáról. Ép DNS-t nyilvánvalóan nem lehet egy ősmaradványból remélni, de pl. a fúziós PCR segítségével kisebb darab DNS-eket is lehet amplifikálni, a bennük tárolt információt szekvenálással kinyerni, majd evolúciós következtetéseket levonni. A PCR legnagyobb hírverést kapott őslénytani alkalmazásának a dinoszauruszok korából származó DNS minta (borostyánkőbe zárt rovarból) PCR sokszorosítása és szekvenálása tűnt, de később kiderült, hogy a minta későbbi korok DNS-ével volt szennyezve. Viszont valós eredményeket kaptak több ezer éves mintákból. Az eddigi legérdekesebb eredmény a legalább 50 ezer éve kipusztult neandervölgyi ősember gyakorlatilag teljes genomjának feltárása volt (ld. 9.4. fejezet), annak ellenére, hogy töredezett DNS-t lehetett csak a csontmaradványokból kivonni.

84 Az archeológiai kutatások esetén a PCR-t több szempontból is használhatjuk. Az egyik fő irány az emberi populációk, népcsoportok csontmaradványaiból származó DNS analízise, másrészt a régészeti lelőhelyeken talált további biológiai eredetű minták (háziállatok, termesztett növények, ételmaradványok, szerves eredetű tárgyak) PCR sokszorosítása, szekvenálása és azonosítása. Másrészt azt a biológia sajátságot használhatjuk ki, hogy a megtermékenyítés után a fejlődő embrió mindig az anyai mitokondriumot örökli. A

mitokondriumban található DNS alapján pedig képesek vagyunk az egyes népcsoportok földrajzi

elhelyezkedését és ennek változásait nyomon követni, valamint a népcsoportok között található rokonsági kapcsolatokat is felderíthetjük ezzel a módszerrel. Például archeo-PCR vizsgálatsorozattal igyekeznek genetikusok és archeológusok együttműködésében feltárni a honfoglalás kori magyarság genetikai eredetét.

A honfoglalás időszakából származó csontmaradványokból vonnak ki DNS-t és ebben az esetben az apai öröklődésű Y kromoszómára jellemző marker régiókat amplifikálnak (a töredezettség miatt a mintákat először random PCR-nek vetik alá) multiplex PCR-rel.

6.6. További olvasnivaló a fejezethez

Erlich HA, Arnheim N. (1992) Genetic analysis using the polymerase chain reaction. Annu Rev Genet.

26:479-506

Hofreiter M, Serre D, Poinar HN, Kuch M, Pääbo S. (2001) Ancient DNA. Nat Rev Genet. 2(5):353-9.

Valasek MA, Repa JJ. (2005) The power of real-time PCR. Adv Physiol Educ. 29(3):151-9.

Saunders, NA and Lee, MA, editors (2013) Real-Time PCR: Advanced Technologies and Applications.

Caister Academic Press. ISBN: 978-1-908230-22-5

85