Könyvtár vektorok

A könyvtár legfontosabb paramétereit a választott vektor határozza meg. A befogadható inszert méreten kívül a vektortól függ többek között az is, hogy milyen gazda rendszerben tartható fenn és szaporítható a könyvtár. Ezért mindenképpen szót kell ejteni az egyes vektorcsaládok könyvtárkészítés szempontjából releváns tulajdonságairól.

A korábban részletesen bemutatott plazmid vektorok (ld. 7.2. fejezet) elvileg alkalmasak bármilyen típusú könyvtár befogadására, azonban van néhány olyan alkalmazhatósági korlátjuk, ami miatt mégsem

használjuk őket genomiális könyvtárak készítésére. Az egyik ilyen probléma az, hogy a plazmidokkal való transzformálás hatékonysága nagyon alacsony, és a plazmid méretének növekedésével ez a hatékonyság tovább romlik. Ezen kívül a nagy inszertet tartalmazó plazmidok nem tarthatók fenn stabilan, ugyanis több példányban vannak jelen a sejten belül, és egymás közti rekombinációs folyamatok révén hajlamosak elveszteni az inszert egy részét, illetve átrendezni azt. A plazmidok egyébként alkalmasak nagyobb, akár 10-15 kbp méretű inszertek befogadására, azonban a transzformáció rossz hatékonysága és a nagy inszertek instabilitása miatt kielégítően működő, azaz változatlan információtartalommal fenntartható plazmid könyvtárat csak sokkal kisebb, 3-5 kbp méretű inszertek alkalmazásával lehet létrehozni. A plazmidoknak ezek a hátrányos tulajdonságai ösztönözték a kutatókat a hatékonyabban transzformáló, és nagyobb inszertek befogadására képes vektorok fejlesztésére (ld. 7. fejezet).

8.2.3. -fág könyvtárak

A -fágot az 1950-es évek óta intenzíven tanulmányozzák. Életciklusa, génjeinek szabályozása részleteiben is jól ismert. Ez tette lehetővé, hogy módosításával számos, a mikrobiális genetikai, molekuláris genetikai és molekuláris biológiai kutatásokban használható eszközt fejlesszenek ki (ld. 7.3.1. fejezet). A -fág

helyspecifikus (int) és homológ (Red) rekombináz rendszereit elterjedten alkalmazzák rekombináns DNS konstrukciók és genetikailag módosított élőlények előállítására (ld. 14. és 15. fejezetek). Ezen kívül a -fág genom egyszerű módosításokkal klónozó vektorrá alakítható át. A -fág alapú klónozó rendszerek nagy

101 előnye a plazmidokkal szemben az, hogy segítségükkel a rekombináns DNS konstrukciót a -fág fertőzés folyamatának hatékonyságát kihasználva lehet a gazdasejtekbe juttatni. A fág fertőzés hatékonysága a plazmiddal való transzformálásnál kb. három nagyságrenddel nagyobb.

8.2.3.1. -fág könyvtárak létrehozása

A -fág alapú helyettesítő vagy szubsztitúciós klónozó vektorok 25 kbp méretű inszertek befogadására képesek annak függvényében, hogy a fág genomjának mekkora, a lítikus ciklusban való szaporodáshoz nem nélkülözhetetlen részét távolították el az adott rendszerben. Genomiális könyvtárak létrehozására alkalmas vektorok pl. a EMBL3/4, a DASH II és a FIX II.

A -fág könyvtár létrehozása során a genomiális DNS-t ragadós véget eredményező restrikciós

endonukleázokkal hasítják, majd a megfelelő méretű DNS fragmentumokat izolálják. A -fág vektort olyan restrikciós enzimmel kezelik, ami a genomiális DNS fragmentumain kialakított ragadós végekkel

komplementer végeket eredményez. A karokat ezután megtisztítják a köztes, úgynevezett kitöltő (stuffer) szekvenciától. A kitöltő szekvenciára azért van szükség, hogy az „üres”, eredeti állapotú vektor mérete megfelelő legyen ahhoz, hogy az azt tartalmazó fágrészecskék fertőzőképesek legyenek.

A nagyobb inszertek befogadására képes úgynevezett helyettesítő -fág vektorok olyan tulajdonságokkal vannak felruházva, amelyek lehetővé teszik a kitöltő szekvenciát tartalmazó, eredeti állapotú klónok elleni szelekciót. Az egyik lehetőség, hogy a kitöltő szekvenciáról annak vektoron belüli orinetációjától

függetlenül termelődnek azok a fehérjék, amelyek jelenléte gátolja a fágok lítikus ciklusát úgynevezett P2 profágot tartalmazó baktérium törzsekben. Ezeket a vektorokat P2 profágot tartalmazó törzsben használva az E. coli pázsiton nem képeznek plakkot azok a klónok, amelyek a kitöltő szekvenciát tartalmazzák. Ilyen vektort eredeti állapotában előállítani nyilvánvalóan csak P2 profágot nem tartalmazó törzsben lehetséges.

Egy másik lehetőség a kitöltő szekvencia újra beépülése elleni szelekciónak az, ha a kitöltő szekvencia két oldalán egymással megegyező poliklónozó helyek vannak egymáshoz képest fordított orientációban. Egy ilyen vektort két, a poliklónozó helyen belül hasító enzimmel kezelve a keletkező karok az egyik, míg a kitöltő szekvencia a másik enzim által generált, egymással nem kompatibilis tapadós végekkel fognak rendelkezni. Az így kezelt vektor karok közé a kitöltő szekvencia nem tud újra beépülni. A EMBL3 vektor lehetőséget ad a kitöltő szekvencia újra beépülése elleni szelekció mindkét módjára (ld. 8.2. ábra).

8.2. ábra: Rekombináns -fág konstrukcióra történő szelekció

102 A genomiális DNS-t restrikciós enzimekkel darabolják, majd a fragmentumok DNS szálainak 5’-végéről a foszfátcsoportot eltávolítják, hogy a ligálás során eredetileg nem szomszédos szakaszok ne

kapcsolódhassanak össze. A vektor karokat és a genomiális DNS-t a kezelést követően összekeverik, és DNS-ligáz segítségével kovalensen összekapcsolják. A reakció során hosszú konkatamer DNS molekulák keletkeznek, amelyek a fág lítikus ciklusban való szaporodáshoz szükséges összes génből, a virionba pakolódáshoz szükséges cos szekvenciákból, valamint a vizsgált genom egy-egy részletéből felépülő ismétlődő egységekből állnak.

A DNS könyvtárat ezután in vitro fág burokba csomagolják (in vitro pakolás; ld. 8.3. ábra). Ez úgy történik, hogy a könyvtárat összekeverik E. coli sejtek kivonatával, ami tartalmazza a preformált fág burok fej és farok egységeket, valamint a DNS fejekbe pakolását elvégző fehérjéket (in vitro pakoló extraktum).

Ezt a kivonatot olyan fággal (A^) fertőzött sejtekből lehet készíteni, amelyek genomjában mutációval elrontották a DNS virionba csomagolásához nélkülözhetetlen „A” fehérje génje, azaz a burok létrejön a fertőzött sejtben, de a fág DNS nem tud pakolódni. Ezt a sejtkivonatot kiegészítik tisztított A fehérjével, majd a rekombináns DNS-sel. A DNS a cos szekvenciáknál elhasad és a létrejövő molekulák burokba csomagolódnak. Ezzel létrejön a genomiális -fág könyvtár.

8.3. ábra: Rekombináns -fág in vitro pakolása

A rekombináns DNS-t tartalmazó fágok könyvtárából hígítási sort készítenek, majd ennek egyes tagjaival E.

coli sejteket fertőznek és a sejteket 37°C-on inkubálják. A fertőzést követően 10-15 perccel a sejteket 45-48°C hőmérsékletű, 0,6-0,8% agart tartalmazó tápoldatban, ún. top agarban felveszik, majd előmelegített agarlemez felszínére terítik szét. Így a sejtek pázsitot alkotnak, amin tarfoltnak (más néven plakk) nevezett világosabb vagy áttetsző foltok figyelhetőek meg ott, ahová a szétterítés során fággal fertőzött sejt került. A fertőzött sejtből ugyanis a sejt pusztulásakor a környezetébe jutnak az új fágok, amik a szomszédos sejteket fertőzik és elpusztítják azokat, miközben újabb fág részecskék termelődnek. Ezért a fertőzött sejtek

közelében nem tudnak osztódni a sejtek, ez figyelhető meg plakkok formájában. A plakkokból izolálható fágok egy rekombináns DNS klónt képviselnek. A fertőzéshez használt fág hígítás és a fertőzés után keletkezett plakkok száma alapján meghatározható a könyvtár fág koncentrációja, azaz titere is, aminek ismeretében kiszámítható, hogy a könyvtárat milyen mértékben kell hígítani, és hány agar lemezt kell

103 készíteni, hogy az összes klón megjelenjen a lemezeken plakkok formájában. Így előállítható a könyvtár az E. coli pázsiton plakkok formájában.

8.2.3.2. -fág könyvtárak szaporítása, a könyvtár fenntartása

A DNS könyvtár összes tagjának nagy mennyiségben való előállításához a könyvtárral E. coli sejteket kell fertőzni. A fertőzött sejtek az őket fertőző klónt 100-200 példányban állítják elő, és a frissen termelt fágok újabb sejteket képesek fertőzni. Így a könyvtár tagok könnyen szaporíthatóak. Az viszont korántsem biztos, hogy minden klón ugyanolyan mértékben szaporodik a könyvtár növesztése során. A könyvtárban minden klón egyedi, a baktérium sejteknek különböző nehézségű feladatot jelent ezek szaporítása. A felnövesztett könyvtárban általában vannak az átlagosnál jobban és rosszabbul termelődő, azaz alul- és felülreprezentált klónok egyaránt. Egyes klónok akár ki is halhatnak, ha a könyvtár többször is felnövesztésre kerül, ami értékes információ elvesztését jelenti.

A -fág könyvtárak esetében az a legjobb megoldás, hogy a könyvtárat csak egyszer növesztik fel nagy mennyiségben, majd a fágokat izolálják és több adagban lefagyasztják. Így sok kísérletre elegendő mennyiségben és azonos minőségben áll rendelkezésre a könyvtár hosszú időn át. Az együttműködő kutatócsoportok akár meg is tudják osztani egymással a könyvtáraikat, ehhez elég egy lefagyasztott adag fágot elküldeni. Az összes könyvtárra igaz, hogy megfelelő, glicerinnel kiegészített oldatban lefagyasztva hosszú ideig tárolhatóak.

8.2.3.3. A -fág könyvtárak szűrése (szkrínelése) plakk hibridizációval

A korai könyvtárakat, és a modern könyvtárak nagy részét is azért állítják, állították elő, hogy adott géneket és azok szabályozó régióit izolálják további vizsgálatok céljából. A keresett gén szerencsés esetben akár több klón inszertjében is jelen lehet teljes hosszúságában, azonban gyakran előfordul, hogy a keresett információt több, egymással átfedő inszertet tartalmazó klón együttese tartalmazza. Ez az egyik oka annak, hogy általában arra törekednek a könyvtárkészítés során, hogy az inszertek egymással átfedjenek.

A könyvtárat szűrni (szkrínelni) kell, hogy a rengeteg klón közül azonosítsuk azokat, amelyek a keresett információ egészét vagy részleteit tartalmazzák. A szkrínelés gyakran alkalmazott módja specifikus egyszálú DNS vagy RNS próbák használatán alapul és plakk (tarfolt) hibridizációnak hívjuk (ld. 8.4.

ábra). A szűrés első lépéseként a fág könyvtárat E. coli sejtekbe kell juttatni, és olyan sejtpázsitot tartalmazó lemezeket kell készíteni, amelyeken 150-200-fág plakk keletkezik. Ezt követően a lemezekre nitrocellulóz membránt fektetnek. Minden plakkból kerülnek fágok a membránra, így azon létrejön az eredeti lemez lenyomata. Ezután a membránokat nátrium-hidroxiddal kezelik, hogy a fágok fehérje burkát és a DNS-t denaturálják. A DNS-t ezt követően hevítéssel fixálják a membránokon. Az előkészített

membránokat radioaktívan vagy fluoreszcensen jelölt DNS vagy RNS próba oldatába áztatják. A próba szekvenciája komplementer a keresett szekvencia egy részletével, tehát a megfelelő klónok DNS-éhez hibridizál. Radioaktív próba esetén a membránt röntgenfilm segítségével hívják elő, míg fluoreszcens próba esetén a megfelelő hullámhosszon történt gerjesztést követő emissziót detektálják az egyes pontokon. A röntgenfilmen megjelenő, vagy fluoreszcens jelet adó pontok pozíciója a membránon megegyezik az eredeti plakk pozíciójával az agar lemezen, azaz a keresett szekvenciát, vagy annak egy részét tartalmazó klón vagy klónok ezzel a módszerrel azonosíthatók. A módszerhez szükség van a keresett gén szekvenciájának vagy a keresett génhez a genomban közel elhelyezkedő marker ismeretére.

A kiválasztott fágokkal baktérium sejteket fertőznek és friss fágokat termeltetnek, hogy az általuk hordozott genomiális DNS szakasz megfelelő mennyiségben és minőségben álljon rendelkezésre a további

vizsgálatokhoz.

104 8.4. ábra: Plakk hibridizáció

Ha nincs jelen olyan klón a kiválasztottak között, amelyik a teljes keresett szekvenciát tartalmazza, akkor a

„kromoszóma séta” (chromosome walking) módszerével azonosítanak és sorba rendeznek több olyan átfedő inszertet tartalmazó klónt, amelyek együttesen tartalmazzák az összes keresett információt (ld. 8.5.

ábra).

A kromoszóma séta során szükség van két ismert markerre, amelyek a keresett szekvencia két végén találhatóak. Az egyik próbával szkrínelik a könyvtárat, és olyan klónokat azonosítanak, amelyek a keresett információnak ezt a részét tartalmazzák. Ezután restrikciós térképezéssel feltérképezik az adott

fragmentumot, és az első próbától legtávolabbi végével komplementer próbát készítenek, amivel újra szűrik a könyvtárat. Így újabb klónokat találnak, amelyek az új próba szekvenciáját tartalmazzák. A folyamat során kiválasztott, egymással átfedő és sorba rendezett klónok összességét kontignak nevezzük.

105 8.5. ábra: Kromoszóma séta