és 13. fejezet). Fontos emlékeztetnünk rá, hogy az eukariótában a gének általában intronokat is
6. Polimeráz láncreakció (PCR)
6.4. A PCR az alapkutatásban
6.4.1. A PCR termék (amplikon) klónozása és klónozás PCR-rel
A mindennapi géntechnológiai gyakorlatban a PCR terméket, az amplikont sokszor „hagyományos klónozással” rekombináns DNS-sé alakítjuk. Megjegyzendő, hogy az amplikon szigorúan véve nem molekuláris klón, mivel nem feltétlenül egyféle szekvenciát tartalmaz (emlékezzünk, hogy a hibajavító aktivitással nem rendelkező PCR enzimek több hibát vétenek, s a PCR során, lévén in vitro módszer, hiányoznak a sejtek nagy replikációs hűségét biztosító további hibajavító mechanizmusok is).
Az amplikont talán legtöbbször a rekombináns fehérjegyártáshoz szükséges konstrukció elkészítéséhez használjuk fel (azaz a PCR segítségével klónozunk, ld. 6.4. ábra). Ahhoz, hogy valamely prokarióta vagy eukarióta expressziós rendszerben fehérjét tudjunk előállítani, az adott fehérjét kódoló DNS szakaszt egy expressziós vektorban kell bejuttatnunk a gazdasejtbe. PCR segítségével az amplifikáció után két egyszerű lépéssel elő tudjuk állítani a megfelelő konstrukciót. Először a kívánt DNS szakasz felerősítése során a primerekbe már a tervezés során restrikciós endonukleáz helyeket építünk be, amelyek megfelelnek az adott vektor klónozó helyeinek. Ezután hasítjuk a megfelelő enzimekkel az amplikont, s máris jöhet a ligálás a megfelelő módon előkészített expressziós vektorba (ld. 4.2. fejezet).
6.4. ábra: PCR termék klónozásának első lépései a primerekbe beépített restrikciós helyek (zöld és sárga) segítségével
6.4.2. Szekvenálás PCR készülékben
A Sanger által 1977-ben kidolgozott láncterminációs DNS szekvenálás (ld. 5.2. fejezet) jóval hatékonyabbá és gyorsabbá vált a PCR módszerrel kombinálva. A Sanger-féle szekvenálás során a denaturációt követően
79 az alap PCR reakcióval szemben itt csak egy primerről indul a DNS szintetizálás. Ennek megfelelően a templát mennyisége minden ciklusban szaporodni fog (de természetesen nem exponenciálisan, mint a két primeres PCR reakciónál).
6.4.3. Mutagenezis
A PCR segítségével a fehérjemérnökség eszköztára is számottevően bővült. Mind az in vitro, mind az in vivo vizsgálatokhoz képesek vagyunk olyan fehérje mutánsokat tervezni, vagy random módon előállítani, amelyek segítségével jobban megismerhetjük az egyes fehérjék szerkezeti és funkcionális tulajdonságait.
Ebben a fejezetben csak röviden említjük azokat a mutagenezis módszereket, amelyeket PCR segítségével lehet elvégezni. Az in vitro mutagenezis módszerekről további részletek a 11.2.3. fejezetben olvashatnak.
6.4.3.1. Random (error prone: hibát ejtő) PCR mutagenezis
A random mutagenezis során véletlenszerűen okozunk mutációt a DNS szálban. Ezt több módon is elérhetjük. Például ha UV-fénnyel világítjuk meg, vagy mutagén szert alkalmazzunk a PCR során. A random mutációk úgy is bekövetkeznek a DNS sokszorosítás során, ha a PCR reakciót összeállítva nem optimális körülményeket biztosítunk a Taq-polimeráz számára (error prone PCR). Példa erre, ha egyenlőtlen dNTP arányt használunk, vagy Mg2+ helyett Mn2+-t teszünk a reakciópufferbe. A módszert részletesebben a 11.1.2. fejezetben mutatjuk be.
6.4.3.2. Helyspecifikus mutagenezis PCR-rel
A helyspecifikus vagy más néven irányított mutagenezis során a DNS szálon belül jól meghatározott helyre tudunk tervezni mutációt. Az ún. megaprimer PCR és az overlapping PCR módszerek részleteit a 11.2.3.
fejezetben ismertetjük.
6.4.4. Reverz transzkripciós (RT-) PCR
A reverz transzkripciós (RT-) PCR módszer alapja, hogy a reakcióban lévő reverz transzkriptáz enzim képes az RNS templátról DNS-t szintetizálni. Ebből adódóan ezzel a módszerrel tudunk mRNS molekulákat sokszorozni. Az orvosi diagnosztikában az RT-PCR és a valós-idejű PCR kombinálása ideális például az RNS alapú vírusfertőzések vagy rákos sejtmarkerek azonosítására. Az RT-PCR alkalmazásával lehetőség van arra is, hogy kvantitatív módon határozzunk meg transzkripciós szinteket, valamint a módszer
segítségével képesek vagyunk sejt- vagy szövetspecifikus cDNS könyvtárakat létrehozni. Amennyiben egy adott gén expressziós szintjét akarjuk meghatározni, az mRNS-re specifikus 3’- és a komplementer szálra specifikus 5’-oligonukleotidot kell terveznünk. Ha cDNS könyvtár készítése a cél, akkor az érett, tehát intronokat nem tartalmazó RNS-ek átírását kell biztosítani. Ehhez a reakcióhoz olyan oligo-dT primert adunk, ami az érett mRNS 3' végén található poli-A farkával komplementer és így biztosítja annak egy szálú DNS-sé való átírását.
Az RT-PCR során az első ciklusban a reverz transzkriptáz enzim csak az RNS-szálra specifikus primert tudja meghosszabbítani, de a második ciklus során már a komplementer DNS lánc is templáttá válik, s mindkét primerrel beindulhat a „láncreakció” (ld. 6.5. ábra). A probléma az, hogy ennek az enzimnek nincs könnyen hozzáférhető, termofil élőlényből származó változata, ezért a reakcióhoz egy hőstabil
DNS-polimerázra is szükségünk van, amely a második ciklustól kezdheti meg a működését. A RT-PCR során figyelembe kell venni azt a molekuláris sajátságot, hogy a reverz transzkriptáz enzim dNTP kötése
gyengébb a DNS-polimerázoknál, így magasabb koncentrációban kell a reakcióhoz adni.
80 6.5. ábra: A reverz transzkripciós (RT-) PCR sémája.
6.4.5. További PCR módszerek (random, fúziós, multiplex, fészkes és inverz)
A PCR alkalmazásainak még számos változata ismert, amelyekből itt néhányat ismertetünk.
Az ún. random PCR (más néven RAPD: random amplification of polymorphic DNA) során olyan DNS fragmentumok amplifikálása is megoldható, amelyekre nem tudunk specifikus primert tervezni. Ilyen esetben különböző, 8-12 nukleotid hosszúságú, tetszőleges (arbitrary) szekvenciájú primereket használnak (egy PCR-hez egyféle primert), és ezzel végzik az általában genomiális eredetű DNS sokszorosítását, annak ellenére, hogy a primerek letapadási helyét nem ismerjük. Ennek a módszernek az előnye, hogy képesek vagyunk a pontos szekvencia ismerete nélkül is polimorf DNS-ek összehasonlítását elvégezni.
A fúziós PCR (angolul jumping, azaz „ugráló” PCR-nek is nevezik) során lehetőségünk nyílik két különálló DNS fragmentumot az amplifikáció soránk összekapcsolni, vagy részben degradálódott DNS templátról specifikus, hosszabb DNS régiókat amplifikálni. A módszer alkalmazása során, ha a két különálló
fragmentum tartalmaz átfedő szekvenciát, akkor a két DNS szál egy-egy végére tervezett, egy forward és egy reverz primerrel elérhetjük, hogy a keletkező DNS szál már mindkét darabot egyszerre magában
foglalja. Ha a fuzionáltatni kívánt fragmentumok nem tartalmaznak átfedő szekvenciát, akkor első lépésként a szálakra egyenként olyan primereket tervezünk, amelyek közül az egyik szál reverz, míg a másik szál forward primere tartalmazza ugyanazt a szekvenciát. Ezt követően olyan amplikonokat kapunk, amelyek már rendelkeznek azonos, átfedő régiókkal és ezek után már a fent leírtaknak megfelelően tudjuk egyesíteni a két DNS darabot. Ennek a módszernek a segítségével az ősmaradványokból származó fragmentált
genomiális DNS-t képesek vagyunk (legalábbis egy bizonyos határig) újra egy molekulává alakítani, valamint a fúziós PCR alkalmazásával különböző gének egyesítésével egy lépésben tudunk kiméra fehérjéket kódoló konstrukciókat (ld. 12.2.3. fejezet) előállítani (ld. 6.6. ábra).
81 6.6. ábra: A fúziós PCR sematikus ábrázolása. Az első esetben (A) a két fuzionáltatni kívánt DNS szál tartalmaz átfedő régiót. A második esetben (B) az első körben PCR-rel létre hozzuk átfedő szakaszokat, amit a reakció során
egy-egy primer biztosít (narancs), majd ezt követően egy újabb PCR során már a kívánt terméket kapjuk.
A multiplex PCR módszer lényege, hogy a reakcióhoz több különböző primer párt is adunk, így több amplikont kapunk egy amplifikálás során. A több primer pár alkalmazása miatt az egyes amplikonok
mennyisége arányosan kevesebb lesz, mintha két specifikus primert alkalmaznánk. A multiplex PCR további technikai nehézsége, hogy el kell kerülni a különböző primerek egymással kialakított kölcsönhatását, mert azok gátolják a reakció megfelelő végbemenetelét. Fontos a detektálás szempontjából, hogy az
amplikonokat különböző méretűre tervezzük. A módszert többek között patogének azonosítására, DNS-profil készítésére (ld. 6.5.2. fejezet) és nagy teljesítményű genotipizálásra alkalmazzák.
A nested (fészkes) PCR segítségével a nem kívánatos termékek (mispriming) megjelenését küszöbölhetjük ki, amely abból eredhet, hogy az egyik alkalmazott primer aspecifikusan (is) köt a célszekvenciához. A módszer során két, egymást követő PCR-t alkalmaznak, mely során a második primer pár az első páron belül anellál az első termékhez, ezzel nagyban növelve a végső termék specificitását. (ld. 6.7. ábra)
6.7. ábra: A "nested" PCR sematikus ábrázolás. Az első PCR során a nem kívánatos terméket, valamint a célszekvenciát tartalmazó szakaszt erősítjük fel. A második körben a két termék közül a cél szekvenciát tartalmazó
terméket használjuk a továbbiakban templátként.
82 Az inverz PCR olyan esetekben alkalmazható, amikor egy ismert DNS régió környezetében lévő ismeretlen szekvenciát szeretnék feltérképezni (ld. 6.8. ábra).
6.8. ábra: Az inverz PCR sémája
A módszer lényegi lépése, hogy az ismert szekvenciától nagy távolságra valamely restrikciós
endonukleázzal hasítjuk a DNS szálat, majd a mintát hígítjuk, és DNS-ligázzal a DNS fragmentumokat cirkulárizáljuk. Ezt követően a cirkuláris DNS-t az ismert szekvencia régión belül hasítjuk egy másik
endonukleázzal, így olyan lineáris terméket kapunk, amelynek két végét pontosan ismerjük. Erre a templátra már képesek vagyunk PCR-t alkalmazni az ismert régiónak megfelelő primerek segítségével. A módszer gyakorlati szempontból főképp mobilis DNS elemek (retrovírusok, transzpozonok) genomba való beékelődésének pontos helyének meghatározására alkalmazható.