A prokarióta fehérje expresszió optimalizálása

Feltételezzük, hogy sikerült kiválasztanunk a megfelelő prokarióta expressziós vektort és a vele kompatibilis baktérium törzset. Az inszertünk (a kívánt fehérje cDNS-e) megfelelő helyre bekerült az expressziós

vektorba. Sikerült a plazmid transzformálása az expressziós törzsbe, a transzformált baktériumok jól osztódnak. Az indukciót is jól elvégeztük, de vagy nincs termékünk, vagy nem megfelelő a mérete, vagy nem elegendő a mennyisége. Mi lehet a gond, mi a teendő?

1. Nézzük újra át a vektor térképét, nem klónozó vektort használunk-e, ami nem tartalmaz riboszóma kötőhelyet! Megfelelő leolvasási keretben (frame-ben) van-e az inszert. Ez különösen az N-terminális fúziós címkét tartalmazó konstrukcióknál fontos (ld. 12.2.3.). A hárommal nem osztható számú hasítóhelyekkel óvatosan kell bánni (ilyen pl. a NotI), mivel ezek könnyen eltolhatják a leolvasási keretet.

2. Szekvenáljuk a plazmidban lévő inszertet! Nincs-e benne deléció, inszerció, ami frame eltolást vagy STOP-kodon beépülést okoz. A plazmid promótere és a transzkripciós terminációs szekvencia kiváló primerül szolgál a szekvenáláshoz. Ez a pET-plazmidoknál maga a T7-promóter (T7forward), vagy a T7Term (T7Term-reverse).

3. Kövessük nyomon a fehérjénk sorsát! Vegyünk mintát minden lépésnél, futassuk meg a mintákat SDS-poliakrilamid gélelekroforézissel (SDS-PAGE) és festéssel, vagy Western-blottal ellenőrizzük a kapott terméket. Legyen mintánk az indukálatlan sejtekből, majd az indukció után is a sejtekből, a sejt feltárása és centrifugálása után a felülúszóból és a pelletből (csapadék, ami a centrifugacső alján összegyűlt), majd az összes tisztítási lépés után is. (A fehérjék tisztítását ld. 12.2.4. fejezet.)

4. Van fehérjénk, csak sajnos nem az oldható frakcióban, ami a sejt lizátum felülúszója, hanem a csapadékban. Ez azt jelenti, hogy a fehérjénk oldhatatlan formában van a zárvány testben (más néven inklúziós test). Ekkor két lehetőség áll előttünk: az inklúziós testből preparáljuk tovább a rekombináns

164 fehérjét minden hátrányával és előnyével együtt, vagy megpróbáljuk eltolni a fehérje termelést az oldható forma irányába.

5. Nagyon kevés fehérjénk van. Miért nem expresszálódik a fehérje?

 Próbáljuk optimalizálni az indukciós körülményeket; hőmérséklet, idő, indukciós ágens koncentrációja.

 Korai terminálódás, mert ritka kodonok vannak az inszertben közel egymáshoz (olyanok, amelyekre nincs elég antikodont hordozó tRNS a gazdasejtben) - pl. humán fehérjét szeretnénk expresszáltatni prokariótában, ahol más bizonyos aminosavak kodon preferenciája. Használjunk olyan baktérium törzset, amely ritka kodonokat is használ (pl. Rosetta, a Novagen cégtől, vagy CodonPlus, a Stratagene cégtől). Emlékezzünk, fajonként más és más a kódszótár kodon használati gyakorisága! Az E. coli és a humán kódszótárak kodon gyakoriságát a 12.1.

táblázatban hasonlítjuk össze. Sárgával emeltük ki az E. coli által használt ritka kodonokat.

 Rövid az mRNS életideje, használjunk olyan törzset, amelyben bizonyos RN-ázok hiányoznak. (pl.

BL21Star)

 Nem elég stabil a fehérjénk és degradálódik a tisztítás során. Használjunk proteáz gátlószereket, tárjuk fel a sejteket óvatosabban, és tartsuk minden tisztítási lépésnél a preparátumot jégen, vagy 4°C-on.

 Fejeztessük ki a fehérjénket expressziót és oldhatóságot segítő N-terminális címkékkel, ilyen pl. a GST illetve MBP címke (ld. 12.2.3.).

 Gondoljuk meg, hátha elég a céljainknak a fehérje kisebb része, N- vagy C-terminális csonkolt része, fragmentuma. Expresszáltassuk a feltehetően rendezetlen N- vagy C-terminális részeket kódoló régió nélküli fehérjét. A fragmentumot kódoló templát DNS-t szubklónozással, in vitro mutagenezissel, PCR módszerrel állíthatjuk elő.

 Toxikus lehet a fehérjénk a gazdasejt számára, ezért használjunk olyan rendszert, amelyben nagyon szigorú szabályozás alatt van a promóter. Ilyenek a pLysS és pLysE plazmidot tartalmazó törzsek.

 Próbáljunk ki más promóterrel rendelkező expressziós vektorokat, más baktérium törzseket.

 Használjunk másik táptalajt a baktérium kultúra növesztéséhez. Általában LB táptalajban fejeztetjük ki a fehérjét, de válthatunk YT, 2YT, Terrific Broth, NzCYM, Nzamin tápra is.

Változtathatjuk a táptalaj NaCl koncentrációját is: 0,2-0,6 M között. Adjunk a növesztéshez glükózt (vigyázat, mert lac-operátort tartalmazó vektoroknál ekkor meg kell növelni az IPTG

koncentrációját!), vagy más cukrot

 Fejeztessünk ki bakteriális dajkafehérjéket (chaperonokokat) a fehérjénkkel együtt a hatékonyabb folding érdekében. Például a DnaK-DnaJ chaperonokat vagy a GroEL-GroES chaperoninokat hordozó expressziós vektorokkal együtt expresszáltassuk a fehérjénket (ld. 12.2.2.4.). Elképzelhető, hogy a fehérjénket csak a kölcsönható partnerével együtt lehet expresszáltatni – ezt is érdemes kipróbálni.

 Váltsunk expressziós rendszert, pl. eukarióta expressziós rendszerre térjünk át (ld. 13. fejezet).

165 12.1. táblázat: Az E. coli és a Homo sapiens kódszótár összehasonlítása

Ne felejtsük el, hogy a rekombináns fehérjék expressziója, bár vannak általános elvek, mégis a tapasztalaton alapul. Kísérletezni kell, hogy melyik körülmény, forma a legoptimálisabb az adott fehérje és az adott konstrukció előállításához.

12.2.2.1. Az indukciós körülmények optimalizálása

Az indukciós körülmények optimalizálása az expressziós idő, a hőmérséklet és az induktor

koncentrációjának a változtatását jelenti, miközben monitorozzuk az expresszálódott fehérje mennyiségét mind a sejtlizátum oldhatatlan (centrifugálás utáni csapadék), mind az oldható frakciójában (felülúszó). Az expresszált fehérje mennyiségét nyomon követhetjük SDS-PAGE-val, vagy Western blottal. A Western blot előnye, hogy a specifikus ellenanyag megmondja, melyik „csík” felel meg a gélen a fehérjénknek. Ez akkor különösen nagy segítség, ha nem vagyunk biztosak a fehérje elektroforetikus mobilitásában, vagy kevés a mennyisége. Használhatunk a fehérjénkre, vagy a fúziós címkére specifikus ellenanyagot (His, anti-GST, anti-MBP, anti-Flag, anti-HA). Ez a kísérlet arra a kérdésre is választ ad, hogy termelődik-e (nem történt-e korai termináció) és mennyire stabil (degradálódik-e) a fehérjénk.

Hogyan függ a vizsgált három paramétertől az expresszió mennyisége, sebessége? Minél magasabb a

hőmérséklet, és nagyobb az induktor koncentrációja, annál gyorsabban fejeződik ki a fehérje. Ez olyan gyors lehet, hogy a fehérje megfelelő feltekeredésére, harmadlagos szerkezetének felvételére nem lesz idő, így a fehérje belső hidrofób magjai kívülre kerülnek, s ezen keresztül a fehérjék összetapadnak, aggregátumokat képeznek és oldhatatlan formában kicsapódnak. Ezt általában el kell kerülnünk, mert nehéz a fehérjét visszaoldani, illetve renaturálni úgy, hogy visszanyerje a biológiai aktivitását (kivéve, ha eleve

166 zárványtestből szeretnénk preparálni). IPTG-vel történő indukció esetén, ami a legelterjedtebb indukciós módszer, általában 0,01-1 mM között változtatjuk az IPTG koncentrációját. A hőmérséklet hatása is

könnyen értelmezhető, hiszen minél magasabb hőmérsékleten történik az indukció, annál gyorsabban megy végbe minden folyamat, így a transzkripció és a transzláció is a sejtben. Általában 15-37°C között történik az expresszió. Az optimális hőmérséklet mellett érdemes beállítani az induktor koncentrációját és az expresszió idejét is. Minél hosszabb ideig indukálunk, annál több fehérje keletkezik, ami növeli az esélyét annak, hogy oldhatatlan fehérjét kapunk. Szisztematikusan meg kell nézni a fehérje mennyiségét a

paraméterek változtatásával mind az oldható, mind az oldhatatlan frakcióban.

12.2.2.2. Expressziós törzsek (BL21pLysS, BL21pLysE, Rosetta, BL21Star, stb.)

Sokszor segítséget jelent, ha más törzsben fejeztetjük ki a fehérjénket. Ha például arra gyanakszunk, hogy korai termináció miatt leválik a riboszómáról a mRNS, ezért nincs megfelelő méretű termékünk az

expresszió során. Ha a fehérjénk cDNS-ének bioinformatikai vizsgálata is azt mutathatja, hogy több ritka kodon van egymás után, amin nem áll módunkban módosítani, akkor érdemes olyan gazdatörzset

használnunk, amely tartalmaz ritka kodonú tRNS-eket. Ilyen a BL21 származék Rosetta törzs (Novagene).

Ha rövid az mRNS életideje a sejtben, akkor fejeztessük ki a fehérjénket BL21(DE3)Star sejtekben. Ennek a törzsnek a fenotípusa: F– ompT hsdSB(rB–, mB–) gal dcm rne131 (DE3). Ebből látszik, hogy alkalmas IPTG indukálta génexpresszióra T7-promóteren keresztül, az ompT- és lon- proteázok inaktívak

(defektesek), ami fontos, hogy ne degradálódjon a rekombináns fehérjénk. A fenti tulajdonságok a

BL21(DE3) sejtekben is megtalálható, de a Star-nál még a rne131 jelzés is szerepel, ami azt jelenti, hogy az RNáz-E gén csonkolt, ezért inaktív. Így megnő a sejtben a mRNS stabilitása, életideje.

Ha toxikus a fehérjénk (pl. aktív protein-kinázt, foszfatázt, proteázt fejeztetünk ki), használjunk pLysS törzset, így csak az indukció megkezdésével expresszálódik a fehérje, addig zavartalanul szaporodhatnak a sejtek. A rekombináns fehérjék előállításoz használatos törzsekről kitűnő összefoglaló olvasható itt. Az említett törzsek genotípusáról pedig ezen az oldalon talál az olvasó további részleteket.

12.2.2.3. Promóter optimalizálás

Amennyiben mindent kipróbáltuk, de még így sem expresszálódik megfelelően a fehérje, akkor érdemes más promóterrel is próbálkozni. Ez azt jelenti, hogy más promótert tartalmazó expressziós plazmidba kell az inszertünket szubklónozni. Lehet, hogy a T7lac promóter olyan mértékű expressziót eredményez, ami összes fehérjénket zárványtestbe viszi. Ilyenkor megoldást jelenthet a gyengébb tac vagy lac promóter használata.

Ne felejtsük el, a promóterek csak a nekik megfelelő expressziós törzsben működnek. Például a T7 promóter nem működőképes, ha nincs a baktériumban T7 RNS-polimeráz, ezért ehhez a promóterhez módosított BL21 törzset kell használnunk, mint a BL21(DE3) vagy a HMS174(DE3). (A DE3 profág hordozza a lac-promóter szabályozása alatt a T7 RNS-polimeráz génjét.)

12.2.2.4. Koexpresszió

A koexpresszió azt jelenti, hogy egyszerre egy sejten belül több polipeptidláncot fejeztetünk ki. Szükségünk lehet erre, ha például egy heterodimer fehérjét kell előállítanunk rekombináns formában. További előny lehet, hogy már a sejten belül létrejön a két polipeptidlánc (vagy fehérje) közötti kölcsönhatás, ami segíthet a láncok feltekeredésében, vagy ha a bennünket érdeklő fehérjével együtt egy módosító enzimet

expresszálunk, a posztranszlációsan módosított rekombináns fehérjét izolálhatjuk a gazdasejtből. Jó példa erre, ha egy fehérjét aktív formában szeretnénk előállítani (pl. egyes MAPK enzimeket), de az aktiváló foszforiláció nélkül ez nem sikerülhet. Megoldást jelenthet, ha a MAPK fehérjét az aktiváló protein-kinázzal (MAPKK) együtt fejeztetjük ki. Így megkapjuk a MAPK fehérjét aktív, foszforilált formában.

Koexpresszióra prokariótákban többféle lehetőségünk van:

167

 Egy promóter, több RBS és inszert cDNS, azaz egy policisztronos mRNS-t kapunk, amelyről több fehérje expresszálódik (mint a bakteriális operonoknál). Ilyenkor a mRNS-hez több riboszóma is kötődik az RBS-eknek megfelelően, és egyszerre kezdi a fehérjék szintézisét. Megjegyzendő, hogy a promóterhez közelebb elhelyezkedő ORF-ről több polipeptidlánc fog szintetizálódni.

 Több azonos promóter egy plazmidon, amelyről így többféle mRNS íródik át. A módszert például heterodimer fehérje előállítására használhatjuk.

 Több plazmid, amely különböző inszertet hordoz. De ennek feltétele, hogy más legyen a plazmidok replikonja, azaz különböző kompatibilitási csoportba tartozzanak és különböző antibiotikum rezisztencia gént hordozzanak (ld. 7.2.1 fejezet).

 Egy promóterhez fúziós fehérjeként kapcsoljuk a két különböző fehérjeláncot. Azaz nem használunk STOP kodont az első fehérjét kódoló szekvencia után, hanem rögtön következik a másik polipeptidet kódoló szekvencia.