Fúziós rekombináns konstrukciók

Sokszor az is megoldás lehet a sikertelen expresszióra, ha a kívánt fehérjénket fúziós fehérjeként fejeztetjük ki. Ekkor a fehérjénk vagy N-, vagy C-terminális részére, vagy mindkettőre tervezhetünk címkét (tag-et).

Ezek a címkék segíthetik a

 fehérjénk oldhatóságát, expresszióját,

 olyan szignál szekvenciákat tartalmazhatnak, amelyek megfelelő kompartmentekbe irányítják a fehérjét,

 segítik a fehérje tisztítását affinitás kromatográfiával

 lehetővé teszik a fehérje nyomonkövetését is, pl. enzimaktivitásuk révén vagy antigénként szolgálhatnak Western-blot esetén

A 12.1. videon egy fúziós rekombináns fehérje tisztítása mutatjuk be affinitás kromatográfiával, FPLC készülék segítségével

12.1. video: Fúziós rekombináns fehérje tisztítása affinitás kromatográfiával (FPLC)

168

12.2.3.1. GST-címke

A GST, azaz a glutation-S-transzferáz olyan enzim, amely glutation felhasználásával a sejtben lévő kis toxikus molekulákat lebontja. A GST kompakt, globuláris, nagyon stabil fehérje, 25 kDa molekulatömeggel.

Nagyon jól kifejeződik és oldatban marad prokarióta sejtekben, ráadásul segíti a hozzá kovalensen kapcsolt fúziós partner kifejeződését is, ha a kifejezendő fehérje N-terminálisára tesszük. Továbbá a GST-címkén keresztül a fehérje nagyon jól tisztítható affinitás kromatográfiával. Az előre gyártott glutation-agaróz gyantához (számos cég árulja) ugyanis a GST nagyon nagy affinitással kötődik (szubmikromólos a KD). A gyantához nagy affinitással kötődő fehérjéket szabad glutationt tartalmazó oldattal (10-20 mM) eluálhatjuk.

Így elég tiszta fehérje preparátumot kapunk. A GST-gyanta nagy kapacitácú; 1 ml tiszta gyanta kb. 6-8 mg fehérjét tud megkötni, és használat után regenerálható. GST-címkével expresszálhatjuk a fehérjénket, ha pl.

pGEX expressziós vektorok valamelyikével dolgozunk. Részletesebben itt olvashatnak róla.

12.2.3.2. MBP-címke

Az MBP (maltose-binding protein), vagyis a maltóz-kötő fehérje az E. coli malE génjének 42 kDa tömegű terméke. A fehérje a baktérium maltóz transzportjában játszik szerepet, ezért erős affinitással kötődik a maltózhoz (a K_D < 1 µM). Ez a tulajdonsága lehetővé teszi, hogy az agaróz gyöngyhöz immobilizált maltóz a sejtlizátumból megkösse az MBP-fúziós fehérjénket, amelyről szabad maltózzal eluálható a fehérje. Az elúciós oldatunk kb. 10-30 mM maltózt kell tartalmazzon. Mivel a fehérje a baktérium saját fehérjéje, ezért az N-terminálisan hozzákapcsolt fehérje expressziós tulajdonságait (pl. oldhatóság) is jelentősen javíthatja.

MBP-fúziós fehérjét a pMal sorozat (New England Biolabs) vektoraival lehet előállítani.

12.2.3.3. Polihisztidin-címke

Talán a leggyakrabban használt fúziós rendszer. 6-10, de leggyakrabban 6 hisztidin aminosavból álló címke, amit tervezhetünk a fehérje N-, vagy C-terminális végére is. Kisméretű címke, ezért feltehetően a legkevésbé zavarja a fehérje működését. Nagy affinitással kötődik a Ni-gyantához (Ni²⁺-ionokat kötnek koordinációs kötéssel a gyanta speciális csoportjaihoz). A kötődés azon alapul, hogy a Ni²⁺-ion koordinációs szférájának a felét foglalják csak el a gyanta funkciós csoportjai, így a hisztidin imidazol gyűrűjének

nitrogénatomja koordinációs kötést hoz létre a fémionnal is. Ez a kötés elég erős, de fémkelátorokra (EDTA, EGTA) nagyon érzékeny. Ezért az affinitás kromatográfiai lépések során ezeket a komponenseket kerülni kell, mert „leszedik” a fémiont a gyantáról. Szintén kerülni kell a Ni-ionnal csapadékot képező vegyületeket, ilyenek a biokémiai redukálószerek, a DTT, vagy a béta-merkaptoetanol, mivel ezek tönkreteszik a gyantát, illetve az oldat pH-ja sem lehet túl lúgos, vagy savas. Viszont ezt az affinitás kromatográfiás lépést lehet erős detergens jelenlétében, vagy denaturáló körülmények között is használni (pl. preparálás inklúziós testből). Nemcsak Ni²⁺-ion, hanem Co²⁺-ion is lehet az agaróz gyantához koordinálva, ezért ezt a tisztítási módszert fém-affinitás kromatográfiának (metal-affinity chromatography) hívjuk.

Az elúció itt is kompetíción alapul, imidazol oldattal (50-500 mM) szorítjuk le a gyantáról a fehérjénket. Ez a legelterjedtebb módszer, de az elúció megoldható a pH csökkentésével is. Ilyenkor lassan csökkentjük a pH-t, először a kevésbé specifikus kötések, majd az erősebb kötések szűnnek meg. Az ok, hogy a pH csökkenésével a hisztidin nem-kötő elektronpárral rendelkező N-atomja protonálódik, és nem tud

koordinálódni a Ni²⁺-hez. Ezáltal fokozatos elúciót érhetünk el, így tisztább lehet a fehérje preparátumunk (a Ni²⁺-gyanta nemcsak polihisztidin-címkés fehérjéket köt, hanem más fehérjéket is, ahol térközelben vannak hisztidin aminosavak, persze azokat kisebb affinitással). A 12.7. ábraán látható egy 85 kDa tömegű fehérje Ni²⁺-affinitás kromatográfiával történő tisztítása.

A tisztítás különböző lépéseiben mintát vettünk, és megfuttattuk SDS-poliakrilamid gélen, amit

fehérjefestékkel (Coomassie Brilliant Blue) hívtunk elő. Látható, hogy a 100 mM imidazollal történő elúció nem elég ahhoz, hogy leszorítsa a gyantáról a fehérjénket, míg 400 mM imidazollal nagy mennyiségű, viszonylag tiszta preparátumot kapunk.

169 A His-taget gyakran kombinálják más címkékkel is, pl. N-terminális GST-, vagy MBP-fúzióval. A

tisztításnál először Ni²⁺-affinitás kromatográfiával izoláljuk a sejtlizátumból a fehérjét, majd a másik címke felhasználásával a másik kromatográfiás tisztítást is elvégezzük. Ezáltal jelentősen megnövekszik a fehérje tisztasága és ha a két címke a fehérje két oldalán található, ez lehetőséget teremt arra is, hogy csak a teljes hosszúságú fehérje maradjon a preparátumban.

12.7. ábra: Ni²⁺-affinitás tisztítás gélelektoforetikus képe. 1. sáv: fehérje marker; 2. sáv: a sejt nem oldható frakciója (centrifugálás utáni csapadék); 3. sáv: a sejt oldható frakciója (felülúszó); 4. sáv: elúció 100 mM imidazollal; 5. sáv:

elúció 400 mM imidazollal

12.2.3.4. Egyéb címkék

Sok egyéb expressziós vektorban van lehetőség címkével ellátott fehérje kifejezésére (ld. 12.2. táblázat).

A kérdés csak az, mi a célunk. Növelni akarjuk a fehérje oldhatóságát, expresszióját vagy nagyobb mértékű tisztítást szeretnénk elérni? Nyomon szeretnénk követni a fehérjénk kifejeződését, lokalizációját pl.

eukarióta sejtekben? Általában elmondhatjuk, hogy egy címkének több funkciója is van, és csoportosításuk egyik alapja éppen a felhasználás lehet. Ez alapján beszélhetünk affinitás, szolubilizációs, epitóp, vagy akár fluoreszcens címkéről is. Egy-egy címke több csoportba is besorolható, pl. a GST-címke növeli a fehérje oldhatóságát, lehet affinitás-alapú tisztításra használni, és még ellenanyag is készült rá, amivel nyomon lehet követni. Az alkalmazott címkék ellen általában létezik ellenanyag, így Western-blottal vagy eukarióta sejtek esetén immunfestéssel láthatóvá tehetők. Léteznek olyan eukarióta vektorok is, amelyek fluoreszcens fehérjéket, vagy enzimaktivitással rendelkező fehérjéket kínálnak fúziós címkének. Ilyen címke a GFP (green fluorescent protein) és változatai, vagy az enzimaktivitással rendelkező β-galaktozidáz, illetve luciferáz. Ezeket azonban felhasználásuk miatt az eukarióta expressziós rendszernél tárgyaljuk.

Az expressziós címkék használatáról itt találnak további hasznos információkat.

170 12.2. táblázat: Fúziós címkék és alkalmazásaik

12.2.3.5. A fúziós címkék eltávolítása

A nagyobb méretű címke jelenléte befolyásolhatja a fehérje biológiai funkcióját pl. aktivitását, kötődését más fehérjéhez, vagy a harmadlagos, negyedleges szerkezetének kialakulását. Például a GST dimerizációra hajlamos, így már eleve rákényszerítheti a fúziós partnerét is, hogy dimerizáljon. Ezen okok miatt érdemes tisztítás után a fehérjéről valamilyen proteázzal levágni a fúziós címkét. Számos vektorban már eleve betervezték a proteáz hasító/felismerőhelyét. Természetesen olyan enzimeket kell használni, amelyeknek nagyon speciális hasítóhelye van, és ritkán fordul elő a fehérjékben, így nem hasítja más helyeken is a rekombináns fehérjénket. Néhány esetben a kémiai hasítás is szóba jöhet; pl. a bróm-cián AspPro

aminosavak között hasít. A 12.3. táblázat foglalja össze a leggyakrabban használt proteolitikus enzimeket hasítóhelyeikkel együtt.

A proteázzal való hasítás történhet az elúció után, oldat fázisban. Ilyenkor a fúziós címkétől, a nem hasított fúziós fehérjétől és a proteáztól is meg kell tisztítanunk a fehérjénket valamilyen kromatográfiával.

Kisméretű (peptid) címkéket el lehet távolítani dialízissel, vagy gélszűréssel. Másik lehetőség, hogy a gyantára felkötött és mosással tisztított fehérjéről az oszlopon hasítjuk le a fúziós címkét. Ilyenkor a címke az affinitás oszlopon marad, míg a fehérjénk „lecsöpög” az oszlopról. Ekkor csak a proteáztól kell

megszabadulnunk. Vigyáznunk kell, hogy a proteáznak és a fehérjénknek is megfelelő puffert alkalmazzunk a hasítás során.

171 12.3. táblázat: Fúziós címke lehasítására alkalmas proteolitikus enzimek és jellemzőik