A rekombináns DNS technológia („génsebészet”, genetic engineering) eszköztára lehetővé teszi az élőlények egyes tulajdonságait meghatározó gének azonosítását, jellemzését és szabadon történő megváltoztatását. Megismerhetjük akár egy adott élőlény teljes genetikai állományának (genom)
információtartalmát is, hiszen napjainkra a DNS szekvenálása rutinszerű feladattá vált. Feltárhatjuk a gének működését szabályozó régiókat. Célzottan, irányított mutációkat hozhatunk létre, sőt, akár teljes géneket is eltávolíthatunk az adott élőlényből, illetve módosított, mutáns géneket vihetünk be kísérleti élőlényekbe (reverz, azaz fordított irányú genetika). Ilyen módon megérthetjük az egyes gének, illetve az általuk kódolt fehérjék működését. A genetikai kód univerzális mivoltát kihasználva lehetséges géneket „átültetni” más organizmusokba, ahol megtörténhet a bevitt szekvencia transzkripciója és transzlációja. Az ilyen
organizmusokat felhasználhatjuk arra, hogy a kódolt fehérjét nagy mennyiségben és tisztaságban állítsuk elő (heterológ fehérje expresszió). Ez a lehetőség az alapkutatások mellett (a termelődő fehérje működésének és szerkezetének vizsgálata) a biotechnológiai ipar illetve a gyógyszeripar szempontjából is kulcsfontosságú.
Az expresszált fehérjét kódoló szekvenciát módosítva számunkra hasznos változatokat hozhatunk létre az adott fehérjéből. Akár az eredetitől eltérő funkciót, vagy aktivitást is „hozzárendelhetünk” ilyen módon egy fehérjéhez (fehérjemérnökség vagy protein engineering). Arra is lehetőségünk nyílhat, hogy saját
sejtjeinkbe juttassunk be új genetikai információt bizonyos betegségek gyógyítása érdekében (génterápia).
Ahhoz, hogy a géntechnológiát ténylegesen alkalmazni lehessen, rekombináns DNS molekulákat kell előállítanunk. A rekombináns DNS egy hordozó DNS molekulából (vektor) és a vizsgálni kívánt DNS-ből (inszert) álló „hibrid” (kiméra) molekula, amelyet a kísérletekhez szükséges mennyiségben
molekuláris klónozással állítunk elő.
.
A molekuláris klónozás nem más, mint egy specifikus inszertet tartalmazó rekombináns DNS felszaporítása megfelelő gazdasejtben (E. coli). Ezeknek a sejteknek a klónjaiból (bakteriális kolóniák) izolálhatjuk a molekuláris klón rekombináns DNS-t. Létezik in vitro DNS szaporítási módszer is, a
polimeráz láncreakció (PCR), azonban ezzel a módszerrel szigorúan véve nem molekuláris klónokat állítunk elő (ld. 6. fejezet).
2.1. In vitro rekombináció
A történeti összefoglalóból már kiderült, hogy a molekuláris klónozáshoz egyrészt fel kellett fedezni azokat az enzimeket, amelyekkel a DNS molekulát in vitro „szabni-varrni” lehet, másrészt találni kellett olyan DNS molekulákat, amelyeket vektorrá lehet alakítani (a vektorokkal szemben támasztott kritériumokról és a típusaikról részletesen a 7.1. fejezetben lesz szó). Végül az in vitro előállított rekombináns DNS-t egy gazdasejtbe kell juttatnunk (ld. 4.3. fejezet) és valamilyen úton-módon ki kell szelektálni azokat a sejteket, amelyekbe az általunk megtervezett rekombináns DNS került be.
A DNS „manipuláció”, a molekuláris klónozás in vitro szakaszának legfőbb eszközei a restrikciós endonukleázok és a DNS-ligáz enzim (a géntechnológiában használatos DNS-módosító enzimekkel részletesen a 3. fejezet foglalkozik).
A restrikciós endonukleázok (röviden restrikciós enzimek) foszfodiészter kötést hidrolizáló enzimek. A baktériumokat az idegen DNS-ekkel szemben „védelmező” molekuláris rendszer (ld. 1.2. fejezet), a
restrikció-modifikáció DNS bontó elemei, amelyek nagy számban és sokféleségben állnak a géntechnológus rendelkezésére. Az enzimek többsége középpontosan szimmetrikus, ún. „palindrom” szekvenciákat ismer fel. Amennyiben a DNS két szálának elhasítása egymással szemközti foszfodiészter-kötéseknél történik, úgynevezett tompa végek (blunt end) keletkeznek (pl. DraI, ld. 2.2. ábra). Ha azonban egymáshoz képest elcsúsztatva, néhány bázissal távolabb a felismerőhely szimmetriatengelyétől, úgy ragadós végek (sticky
rekombináns DNS = vektor DNS + inszert DNS
24 end) jönnek létre (pl. EcoRI, ld. 2.1. ábra). A DNS-ligáz enzim foszfodiészter kötés létrehozásával képes két DNS molekulát, vagy egy molekula két végét kovalensen összekapcsolni. Ha két különböző eredetű DNS molekulát EcoRI enzimmel hasítunk, majd összekeverünk, akkor a DNS-ligáz in vitro
rekombinációval létrehozhat hibrid, azaz rekombináns DNS molekulákat, mint azt a 2.1. ábra szemlélteti.
A restrikciós endonukleázokkal részletesen a 3.2.1. fejezet foglalkozik.
2.1. ábra: In vitro rekombináció. Két különböző eredetű DNS hasítása EcoRI restrikciós endonukleázzal. A létrejövő DNS fragmentumok egymást felismerő ragadós végekkel rendelkeznek. Összekapcsolásuk DNS-ligáz segítségével
történik. Amennyiben a két különböző eredetű DNS-vég kapcsolódik össze, in vitro rekombináció történik.
Megjegyzendő, hogy egy DNS molekula két végén található ragadós végeket is összekapcsolhatja a DNS-ligáz. Ebben az esetben nem jön létre rekombináció, hanem pl. ha egy linearizált vektor DNS-ről van szó, az cirkularizálódik. Az
ún. vektor „önzáródás” kiküszöbölhető, ha a hasított DNS 5’-végéről a foszfát-csoportokat foszfatáz enzimmel eltávolítjuk (ld. 3.4.2. fejezet)
2.2. Rekombináns DNS létrehozása
A molekuláris klónozás in vitro szakaszában alakítjuk ki a rekombináns DNS-t. A hordozó DNS leggyakrabban egy cirkuláris plazmid vektor (a plazmidok extrakromoszomális elemek, a
baktériumsejtekben önállóan replikálódó ún. replikonok, ld. 7.2. fejezet)), míg a vizsgálandó DNS lehet egy eukarióta kromoszóma. Példaként egy olyan klónozási stratégiát mutatunk be, ahol az inszertet a
kromoszómából két különböző restrikciós enzimmel hasítjuk ki. Ha a vektor DNS-t ugyanazon két restrikciós endonukleázzal hasítjuk és a tisztított hasítási termékeket összekeverjük, a DNS-ligáz a
kémcsőben lezajló reakció során gyakorlatilag csak ezt a kétféle eredetű DNS-t képes egymáshoz kapcsolni, ezáltal rekombináns DNS jön létre, mint azt a 2.2. ábra mutatja. Ez a direkcionális vagy irányított klónozás, amit részletesen a 4.2. fejezetben ismertetünk.
25 2.2. ábra: Rekombináns DNS létrehozása irányított klónozással. A plazmid vektort és a kromoszomális DNS-t is ugyanazzal a kétféle restrikciós enzimmel hasítjuk. Az egyik végén "ragadós" (EcoRI), a másik végén "tompa" végű
(DraI) DNS molekulákat a DNS-ligáz kovalens összekapcsolja, ezzel létrejön a rekombináns DNS.
2.3. Molekuláris klónok kialakítása
A DNS klónozás in vivo szakasza a rekombináns DNS gazdasejtbe juttatása és felszaporítása. A DNS sejtekbe juttatására többek között a bakteriális transzformáció jelenségét lehet kihasználni (további génbeviteli eljárások leírása a 4.3. fejezetben olvasható). Egy baktérium sejt általában csak egyetlen rekombináns DNS-t vesz fel. Mivel a transzformáció hatásfoka alacsony, szükségünk van valamilyen szelekciós eljárása. A vektor tartalmaz egy antibiotikum elleni védelmet biztosító gént (antibiotikum rezisztencia gén), amely megfelelően választott körülmények között szelektív túlélést tesz lehetővé a rekombináns DNS-t hordozó sejtek számára. A transzformálás után a sejteket olyan, antibiotikumot tartalmazó, szelektáló táptalajra helyezzük, ahol csak a rekombináns plazmidot (és így az adott antibiotikumra rezisztenciát biztosító gént) tartalmazó sejtek képesek szaporodni. Minden sejtből egy kolónia keletkezik (amely genetikailag azonos sejtekből, klónokból áll). Sok ezer ilyen, a kromoszóma különböző darabját tartalmazó kolónia együttesen egy genomiális könyvtárat reprezentál (ld. 8.2. fejezet).
Egy-egy kolónián belül azonos rekombináns DNS-t tartalmazó sejtek vannak, melyeket tovább lehet szaporítani, és a klónozott DNS-t izolálni lehet. A folyamat sémáját a 2.3. ábra mutatjuk be.
26 2.3. ábra: A molekuláris klónozás elvi vázlata. A rekombináns DNS-t transzformációval juttatjuk az E. coli gazdasejtbe, ahol az a baktériumsejt kromoszómájától (amit nem ábrázoltunk) függetlenül replikálódik és több kópiában lesz jelen az utódsejtekben, ezzel is hozzájárulva a DNS klón felszaporításához (amplifikáció). A különböző
inszerteket tartalmazó baktériumok egyedi klónok. A kromoszóma egészét darabokban tartalmazó E.coli klónok összessége a genomiális könyvtár (ld. 8.2. fejezet). A rekombináns DNS a sejtekből tiszta formában egyszerűen
kinyerhető (ld. 4.1.1. fejezet).]
2.4. További olvasnivaló a fejezethez
Watson, JD et al. (2007) Recombinant DNA: Genes and Genomes. A Short Course. W. H. Freeman. ISBN-10: 0716728664
Brown TA (2010): Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. Wiley-Blackwell, 6th Edition
27