és 13. fejezet). Fontos emlékeztetnünk rá, hogy az eukariótában a gének általában intronokat is
4.3. Génbeviteli eljárások
A plazmid DNS baktérium, élesztő vagy egyéb eukarióta (élesztő, növény, állat) sejtbe való bejuttatására számos lehetőség áll rendelkezésünkre. Ebben a fejezetben a génbeviteli módszerek közül a baktérium sejtek transzformálását, az eukarióta sejtek transzfektálását, az infekciót, az elektroporációt és a génpuska használatát mutatjuk be.
4.3.1. Transzformálás
A baktérium sejtek képesek a környezetből DNS molekulák (pl. plazmid DNS) felvételére. A jelenséget transzformációnak nevezzük, s ez a horizontális géntranszfer egyik formája (ld. 1.1.2. fejezet). A géntechnológiában a transzformáció a rekombináns DNS baktérium sejtbe juttatásának egyik legáltalánosabban használt módja. A sikeres génbevitelhez először ún. kompetens sejteket kell
létrehoznunk (az a sejt kompetens, amelyik képes a környezetéből DNS-t felvenni). Mivel az E. coli sejtek viszonylag könnyen kompetenssé tehetők, ez a tény is hozzájárult, hogy a géntechnológiában a legfontosabb gazdasejt ez a baktérium faj lett.
58 Kompetens sejteket legegyszerűbben úgy hozunk létre, hogy a sejteket CaCl2-ot tartalmazó oldatban
inkubáljuk (táptalaj összetevők nélkül). Ez elősegíti a plazmid DNS kötődését a baktériumfal
lipopoliszacharidjához. A pozitív töltésű Ca2+-ok vonzzák a negatív töltésű DNS-t. Hősokk hatására pedig a sejtmembrán fluidabb lesz, és a DNS be tud jutni a citoplazmába (a pontos mechanizmust nem ismerjük).
Ilyenkor a sejteket 4°C-ról 42°C-ra melegítjük 30-60 sec-ra (hősokk). A sejteket ezután tápanyagdús közegben hagyjuk regenerálódni, majd szelektív táptalajra szélesztjük őket. A kompetens sejt
transzformációs hatékonyságát számadattal úgy fejezzük ki, hogy kis mennyiségű (néhány ng) plazmidot transzformálunk a gazdasejtbe, megszámoljuk a kolóniák számát az agar lemezen, s azt 1 μg plazmid DNS-re vonatkoztatjuk. 107-108 telep/μg plazmid DNS esetén magas kompetenciáról beszélhetünk. Tapasztalati alapon kidolgoztak olyan protokollokat is (különböző fémion keverékkel kezelve az E. coli sejteket),
amelyekkel még ennél is erősebb kompetencia érhető el (max. 1010 telep/ μg plazmid DNS). A 4.18. ábraán baktérium telepek látszanak agar lemezen.
4.18. ábra: E.coli telepek agar lemezen
4.3.2. Transzfektálás
A transzfekció alapja ugyanaz, mint a transzformálásé, csak itt a célsejtek emlős sejtekből származnak. Az elsőként alkalmazott és legelterjedtebb módszer, a kémiai úton történő transzfektálás, amikor valamilyen kationos hordozóhoz kötődik a negatív töltésű DNS, és ezt a komplexet juttatjuk a sejtbe. A kémiai
módszerek hátránya, hogy sok faktortól függ a transzfekciós hatékonyság, mint például a DNS nukleinsav összetétele, az oldat pH-ja és a sejtmembrán aktuális állapota. Leggyakrabban olyan kationos lipidet használunk (pl. lipofektamin), amely liposzómákat képez, magába foglalva a DNS-t. A liposzóma fuzionál a sejtmembránnal és ez által juttatja be a DNS-t a sejt citoplazmájába.
Igen olcsó és egyszerű módja a kémiai transzfektálásnak, amikor kalcium-foszfátot alkalmazunk. Foszfát ionokat tartalmazó pufferhez (pl. HEPES) kalcium-klorid oldatot adunk a transzfektálni kívánt DNS-sel. Ez által egy precipitátum képződik a pozitív töltésű kalciumból és a negatív töltésű foszfátból, ami megköti a felületén a DNS-t. Ezt a szuszpenziót adjuk végül a sejtekhez, amelyek felveszik a precipitátumot a DNS-sel együtt. Egy másik módszer a kationos polimerekkel (pl. DEAE-dextrán, polietilénimin) történő
transzfektálás. A negatív töltésű DNS a polikationhoz kötődik, majd a sejt endocitózissal veszi fel a komplexet.
A jóval hatékonyabb, és újabban használatos fizikai transzfektálás módszerei közé tartozik még az optikai transzfektálás és az elektroporáció. Az optikai transzfektálás esetében lézer segítségével kisméretű (~1 μm) lyukakat képezünk a sejtek plazmamembránján. A médium és a citoplazma közötti ozmotikus különbség miatt a DNS beáramlik a sejtbe.
59
4.3.3. Elektroporáció
Az elektroporáció az egyik leghatékonyabb módszer a cirkuláris DNS sejtbe juttatáshoz.
Ez a technika a sejt lokális transzmembrán- feszültségétől függ. Az elektroporációt egy elektroporátor nevű berendezéssel végezzük, amely egy elektromágneses teret hoz létre a sejteket tartalmazó oldatban.
A sejtszuszpenziót, a bejuttatni kívánt DNS-sel egy olyan küvettába pipettázzuk, aminek a két oldalán alumínium elektródák találhatóak, és nagyfeszültséget hozunk létre (10,000-100,000 V/cm néhány µsec-msec-ig, a sejt típusától és méretétől függően). Nagyon fontos a megfelelő sókoncentráció. Ha túl magas, akkor elektromos kisülés jöhet létre, ami nagyarányú sejtpusztulást okoz. A nagy térerő ideiglenesen lyukakat képez a foszfolipid kettős rétegen és a sejtfalon. A sejten kívüli nagy plazmid koncentráció miatt hirtelen megindul a lyukakon keresztül a DNS beáramlása a sejt belsejébe. Majd a membrán töltöttsége megszűnik, a foszfolipid kettős réteg összeáll ismét, így gyorsan megszűnnek a pórusok. Ezt követően az életben maradt sejtek nagy arányban tartalmazzák a plazmidot, de azonnal médiumba kell őket helyezni, hogy regenerálódhassanak. Az elektroporáció nagy előnye, hogy szinte minden sejttípusra alkalmazható, és nagy hatékonysággal lehet vele bejuttatni a DNS-t a sejtbe. Hátránya viszont, hogy ha az elektromos pulzusok hossza vagy intenzitása túl nagy, akkor nagy lyukak keletkeznek a sejteken, és elpusztulnak. A 4.19. ábra mutat be egy elektroporátort és a sejteket tartalmazó küvettát.
4.19. ábra: Elektroporáló készülék és küvetta
4.3.4. Infekció
Az infekció rekombináns fág illetve rekombináns eukarióta, vírus által közvetített géntranszfer baktérium vagy eukarióta (elsősorban rovar és emlős) sejtekbe. Egy donor baktérium populációban szaporítjuk fel a fágokat és a recipiens baktériumokat fertőzzük a rekombináns fág populációval. Az eukarióták esetében is csak a vírus specifikus gazdasejtjébe lehet rekombináns DNS-t bejuttatni. A módszer nagy előnye, hogy a transzformációval ellentétben, ami igen kis hatékonyságú génbeviteli módszer, az infekció gyakorlatilag 100% hatékonyságú (növényi gazdasejtek kivételével).
4.3.5. Génpuska
Ez a módszer egy közvetlen géntranszfer, melyet eredetileg növényi sejtek transzformálására fejlesztettek ki.
Egy fémből készült (pl. arany) elemi hordozót bevonnak a bejuttatni kívánt DNS-sel. A génpuska készülék segítségével szinte akármilyen sejtbe be lehet lőni a géneket. A puska hajtóereje nagynyomású hélium
60 gáztartály, ezzel gyorsítjuk fel a lövedéket. A makrolövedékek egy fékező lemezen fennakadnak, míg a mikrolövedékek meghatározott sebességgel szétszóródva becsapódnak a célszövetbe. Az eljárás sikerességét a DNS-sel bejuttatott markerek megjelenése jelzi. Egy génpuska vázlatos rajzát a 15.1.2.1. fejezetben, a 15.3. ábraán mutatjuk be.
4.4. További olvasnivaló a fejezethez
Brown TA (2010): Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. Wiley-Blackwell, 6th Edition. ISBN-10: 1405181737.
Sambrook, J and Russel, DW (2001) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. CSHL Press, volume 1-3, Third edition. ISBN: 0879695773.
61