Nukleázok

nehéz templátokkal való munkára is. Egyetlen hátránya, hogy az említett polimerázok közül ez a

legdrágább.

Néhány további, a PCR-hez használt polimeráz enzimet az 6.2.2. fejezetben ismertetünk.

3.1.5. Reverz transzkriptáz

RNS-függő DNS-polimerázok, amelyek a retorvírusok replikációs ciklusában játszanak szerepet. A retrovírusok genomja RNS-ből áll, amiről DNS másolat készül a gazdaszervezet fertőzése után. A laboratóriumi gyakorlatban reverz transzkriptázok használhatók mRNS molekulákról DNS másolat készítésére. Az így szintetizált, a templát mRNS-el komplementer szálat nevezik cDNS-nek. A cDNS templátként szolgálhat további PCR reakcióhoz. Az mRNS-ből kiinduló, és végül amplifikált DNS terméket eredményező reakciót RT-PCR-nek, reverz transzkripciós PCR-nek hívják (ld. 6.4.4. fejezet). (Az RT-PCR nem összekeverendő a valósidejű, real-time PCR-rel, aminek során a fluoreszcensen jelölt DNS

amplifikációjának kvantitatív meghatározása történik.) A reverz transzkriptáz fontos felhasználási területe a cDNS könyvtárak készítése is (ld. 8.3. fejezet).

3.2. Nukleázok

Számos nukleázt használnak rutinszerűen a mindennapos molekuláris biológiai laboratóriumi gyakorlatban.

A legtöbb nukleázt két csoportra lehet osztani:

 Exonukleázok: olyan enzimek, amelyek a DNS vagy RNS két végéről képesek nukleotidok eltávolítására.

 Endonukleázok: a nukleinsavak közbülső részein található foszfodiészter kötéseket tudják elhasítani.

3.2.1. Restrikciós endonukleázok

A restrikciós endonukleázok baktériumokban, archeákban, és egyes vírusokban megtalálható enzimek, és a restrikciós-modifikációs rendszer komponensei (ld. 1.2. fejezet).

A restrikciós endonukleázok (vagy röviden restrikciós enzimek) specifikus helyeket ismernek fel a DNS molekulán, majd a DNS mindkét szálát átvágva képesek azt elhasítani (foszfodiészter kötéseket

hidrolizálnak). Elnevezésüknek külön nómenklatúrája van. A HindIII enzim nevének magyarázata, hogy a Haemophilus influenzae baktérium d szerotípusából harmadikként izolálták. Hasonlóképpen képezhető az EcoRI enzim neve is: az Escherichia coli RY13 törzséből elsőként izolálták.

Egy random bázissorrendű DNS-t tekintve a statisztikai hasítási gyakoriság attól függ, hogy milyen hosszú az enzim felismerési szekvenciája. Ha az emésztőenzim felismerő helye 4 bázispárt tartalmaz, akkor, mivel minden egyes bázispár helyén négyféle variáció (A, T, G, C) lehetséges, 4⁴ = 256 bázispáronként

számíthatunk hasítóhelyre. Ha a felismerő hely 6 nukleotid hosszúságú, a hasítás valószínűsége 1/4096-ra módosul (4⁶ = 4096). A valóságban a DNS szekvenciája nem véletlenszerű, ezért a hasítóhelyek eloszlása sem teljesen követi a fentieket. Vannak restrikciós endonukleázok, amelyek felismerőhelye megegyezik, de hasítóhelyük különböző, ezeket neoskizomereknek nevezik. Azokat az enzimeket, amelyeknél mind a felismerő, mind a hasítóhely egyforma, izoskizomereknek hívják.

A restrikciós enzimek leggyakoribb felhasználási területe a molekuláris klónozás (ld. 2. és 4.2. fejezetek), valamint a DNS fizikai térképezése (ld. 9.1.1. fejezet) és az ahhoz kapcsolódó területek (pl. diagnosztika, bűnügyi orvosszakértői vizsgálatok). A restrikciós endonukleázokat hagyományosan négy csoportba osztják a felismert szekvencia, a hasítóhely, az alegység kompozíció és a kofaktor szükséglet szerint.

33

3.2.1.1. I-es típusú restrikciós endonukleázok

Multifunkciós fehérjék restrikciós és metil-transzferáz aktivitással rendelkeznek. Komplex, három

alegységből felépülő szerkezetük van, Mg²⁺ szükséges a működésükhöz, valamint kofaktoruk még az ATP és az S-adenozil-L-metionin (AdoMet) is. Hasítóhelyük a felismerési helytől távol (több ezer bázispárnyira) helyezkedik el. Korábban úgy gondolták, hogy az I-es típusú enzimek ritkák, azonban a teljes genomok vizsgálatából kiderült, hogy valójában nagy számban találhatók meg. Bár a szervezet biokémiai

folyamataiban fontos szerepük van, gyakorlati hasznosíthatóságuk kicsi, mert nem szigorúan meghatározott a hasítás pozíciója a felismerő helyhez képest.

3.2.1.2. II-es típusú restrikciós endonukleázok

Változatos szerkezetű enzimek, csak restrikciós funkcióval rendelkeznek (a metiltranszferáz komponenst külön gén kódolja). A működésükhöz Mg²⁺-ot igényelnek. Hasítóhelyük a felismerő helyben vagy annak közvetlen közelében található. Ebbe a családba tartozik a restrikciós endonukleázok túlnyomó többsége, eddig körülbelül 4000 ilyen típusú enzimet írtak le. A felismerőhely általában 4-8 bázispár hosszúságú, és jellemzően palindrom szekvencia. A palindrom kifejezés azt jelenti, hogy a DNS bázissorrendje előre és hátrafelé olvasva (a két, komplementer láncra vonatkoztatva) ugyanaz. Például a KpnI nevű enzim felismerő helye az 5’-GGTACC-3’ szekvencia. Ennek a komplementer párja 3’5’ irányban CCATGG, ami

visszafelé olvasva éppen GGTACC.

A restrikciós enzimek hasítóhelye eredményezhet ragadós véget vagy tompa véget. Előbbinél a hasítás ereményeként az egyik szálon rövid túlnyúló vég jön létre, például az említett KpnI az ötödik nukleotid után hasít (GGTAC/C), és így ragadós véget eredményez, 3’-túlnyúló véggel (ld. 3.4. ábra).

3.4. ábra: Ragadós és tompa végek. A restrikciós enzimek hasításának terméke lehet ragadós végű (sticky end) vagy tompa végű (blunt end) DNS. A) A KpnI enzim ragadós végeket hoz létre, mert a palindrom hasítóhelyet aszimmetrikusan vágja szét. B) A SmaI enzim a hasítóhely közepén vág, ezért nem keletkezik túlnyúló vég.

Ezzel szemben a SmaI enzim, amelynek felismerő helye a CCCGGG szekvencia, a harmadik nukleotid után hasítva (CCC/GGG) tompa véget hoz létre. A restrikciós enzimek egyik legismertebbje, az EcoRI a

GAATTC szekvenciát ismeri fel és az első nukleotid után hasítja (G/AATTC), ezáltal 5’-túlnyúló vég jön létre (ez a gyakoribb túlnyúló vég típus).

A II-es típusú enzimek meghatározott helyen hasítják a DNS-t, így az emésztés reprodukálható és a keletkezett termékek szekvenciája pontosan meghatározott lesz. Ma már több ezer ilyen enzimet

34 ismerünk (>3000 enzim, >250 felismerőhellyel 750 baktérium törzsből) és sok száz kapható kereskedelmi forgalomban. A II-es típusú endonukleázok legtöbbje homodimer szerkezetű (ld. 3.5. ábra), amely szerkezeti tulajdonság egyrészt összecseng a felismerőhely szimmetrikus szerkezetével, másrészt a két azonos DNS-kötőhely (bivalencia) erősebb DNS kötődést tesz lehetővé.

3.5. ábra: Az EcoRI restrikciós enzim térszerkezete. A II-es típusú restrikciós endonukleázok egyik tipikus képviselője az EcoRI enzim. Homodimer szerkezetű, egyenként 31 kDa méretű alegységekből áll. Mindkét alegység tartalmaz egy hurok régiót, amelyek körbeölelik a DNS-t (narancssárga). Az ábrán látható, hogy a DNS aszimmetrikus

elhasadása révén ragadós végek jönnek létre. Az enzim kristályosítása mangán-ionok jelenlétében történt (lila gömbök), amelyek a natív enzimben megtalálható magnézium-ionok helyét foglalják el.

Később több alkategóriáját állították fel ennek az enzimcsaládnak, ahová azok az enzimek tartoznak, amelyek jellegzetes tulajdonságaikban különböznek a tipikus II-es típusú endonukleázoktól. A II.M típusú enzimek például képesek metilált DNS felismerésére és elhasítására is. Ilyen a DpnI nevű restrikciós endonukleáz, amelyet helyspecifikus mutagenezisnél használnak a templát DNS elbontására (ld. 11.2.2.

fejezet). A II.M típusú enzimek meghatározott helyen hasítják a DNS-t, a DpnI hasítólye például GA/TC. A IV-es típusú restrikciós endonukleázoknak is metilált DNS a szubsztrátja, azonban a II.M típustól eltérően nem specifikus helyen hasítanak.

3.2.1.3. III-as típusú restrikciós endonukleázok

Nagyméretű, két alegységből felépülő fehérjék (hidrolizáló alegység és metiláló alegység). Szintén Mg²⁺ -függő enzimek, kofaktoruk az ATP, az S-adenozil-L-metionin segíti a metil transzfer reakciót, de nem feltétlen szükséges a működésükhöz. Hasítóhelyük a felismerési hely közelében (átlalában 25-27

bázispárnyira) található, nem palindrom. Akárcsak az I-es típusú enzimek, itt is két szekvencia részből áll a felismerő hely, és az enzim képes a DNS szál transzlokációjára. A hasítás az egyik felismerő hely közelében történik.

3.2.1.4. IV-es típusú restrikciós endonukleázok:

Módosított, általában metilált DNS-t ismernek fel és hasítanak, specifitásuk alacsony. Nem a restrikciós-modifikációs rendszer részei.

35

3.2.2. Egyéb nukleázok 3.2.2.1. S1-nukleáz

Az Aspergillus oryzae gombából származó S1-nukleáz olyan endonukleáz, amelyik egyszálú DNS-t vagy RNS-t képes lebontani. Az enzim ötször aktívabb DNS-en, mint RNS-en. Kétszálú polinukleotid is lehet az S1-nukleáz szubsztrátja, ha tartalmaz egyszálú szakaszokat, ilyen lehet egy hurok régió vagy egy gap.

Kofaktora a Zn²⁺, pH optimuma a savas tartományban, 4.0-4.3 között van. Felhasználható tompa vég kialakítására, illetve egyszálú DNS és RNS szelektív lebontására.

3.2.2.2. Dezoxiribonukleáz (DN-áz) I

A dezoxiribonukleáz I (DN-áz I), ellentétben a fentebb tárgyalt S1-nukleázzal, egy- és kétszálú DNS lebontására egyaránt képes. A 31 kDa méretű enzim négy izoenzim keveréke, és maximális aktivitást kalcium-, magnézium- vagy mangán-ion jelenlétében mutat. Specifitása és hatásmechanizmusa a jelen levő kofaktortól függ. Míg például Mg²⁺ jelenlétében a két szálat random helyeken hasítja, Mn²⁺ jelenlétében nagyjából egy helyen történik a hasítás, tompa vagy egy-két nukleotidnyi túlnyúló véget kialakítva. A molekuláris biológiai gyakorlatban sokrétűen felhasználható, például didezoxi- (Sanger-féle) szekvenáláskor véletlenszerű DNS fragmentumok kialakítására, vagy jelölt DNS létrehozására hasadás-elmozdulás (nick translation) technikával (ld. 3.3. ábra). Nagyon gyakran alkalmazzák fehérje vagy RNS preparátumok DNS-től való megtisztítására is.