3. Rész A növények növekedésének és alkalmazkodásának hormonális szabályozása
3.1. Fejezet. A növényi hormonok
3.1.3. A növényi hormonok vizsgálati módszerei
A növényi hormonok fiziológiai szerepének vizsgálata magában foglalja azonosításukat és mennyiségük meghatározását. A növényi hormonok szintjének mérését megnehezíti, hogy a rendkívül komplex kémiai összetételű növényi kivonatokban nagyon kis mennyiségben vannak csak jelen. A hormonok és az alapvető anyagcseretermékek (pl. cukrok) koncentrációja közötti különbség elérheti a 10
102 nagyságrendet. Ezért magát a hormonkimutatást megelőzi a komplex növényi kivonat frakcionálása és dúsítása (pl. a vegyületek vizes illetve organikus fázisok közötti megoszlása vagy akár pusztán a méretük révén) (7,8). A növényi hormonok azonosítása és mennyiségi meghatározása megfelelő érzékenységű és specificitású analitikai módszerek hiányában sokáig nem a közvetlen kimutatásukon, hanem a hatásuk mérésén alapult. Ennek alapja, hogy a hormonok már igen kis mennyiségben hatva is jelentős fiziológiai/morfológiai változásokat képesek előidézni. Ezek a változások lehetnek az adott hormonra specifikusak és a mértékük egy adott koncentráció tartományon belül arányos a hormon koncentrációval. Ezek az ún. bioesszék a növényi hormonok felfedezésében is jelentős szerepet játszottak (lásd később). Ilyen pl. az auxin azonosításra és koncentráció meghatározásra használt zab koleoptil görbülési teszt, az etilén koncentráció-függő hatása az epinasztiára, a rizs levéllemez elhajlási teszt, ami a brasszinoszteroidok kvantitatív meghatározására alkalmas, vagy az -amiláz aktivitás teszt amit a gibberellinek specifikus kimutatására használnak (9). Ezeket a klasszikusnak tekinthető hormonkimutatási módszereket költséghatékonyságuk miatt a mai napig használják kisebb pontosságuk ellenére is.
Az 1960-as évektől vált elterjedté a növényi hormonok immunológiai kimutatása enzimkapcsolt immunoszorbens módszerrel (ELISA) illetve radioimmunesszével (RIA) (7,8). Mindkét módszer a növényi hormonnak, mint antigénnek, egy specifikus ellenanyaghoz való szoros kötődésén alapul. Az ELISA vizsgálat során a vizsgált oldatban található antigént szilárd fázishoz kötik majd enzimmel kapcsolt specifikus antitesttel jelölik. Az enzim révén a kapcsolódás színreakcióval detektálható. A reakció erőssége arányos a mintában található antigén mennyiségével. Ez a kimutatási módszer egyszerű és gyors, ezért nagy mennyiségű minta párhuzamos vizsgálatára alkalmas. Az érzékenysége és pontossága azonban változó. A RIA megközelítés érzékenysége nagyobb. Ez a módszer azon alapszik, hogy a molekula radioaktívan megjelölt formája leszorítja a nem jelölt molekulát az ellenanyaggal képzett komplexéből. A radioaktív jelölés kicserélődése pedig kvantitatívan mérhető. Hátránya, hogy radioaktív hormont igényel. Ellenanyagok használhatók növényi hormonok in situ hisztológiai kimutatására is, azonban ez a megközelítés nagy specificitású és affinitású ellenanyagokat és érzékeny detektálási technikát igényel.
A növényi hormonok közvetlen kimutatására számos kromatográfiás módszert dolgoztak ki. A növényi hormonok kutatásának úttörői elsősorban papírkromatográfiát, illetve elektrokémiai elválasztási módszereket alkalmaztak és az így kapott frakciókban a hormonhatású komponenseket bioesszék segítségével azonosították. Napjainkban a hormonok szerkezetének és fiziko-kémiai tulajdonságainak ismerete lehetővé tette, hogy specifikus dúsítási és szükség esetén módosítási lépéseket követően folyadék vagy gázkromatográfiás eljárással pontosan meghatározzuk az egyes hormonok mennyiségét adott növényi mintában (7,8,10). A tömegspektrométerek fejlődésének köszönhetően a növényi hormonok mennyiségi és minőségi meghatározása egyre érzékenyebbé és pontosabbá válik (10). A
„metabolomika” módszereinek fejlődése mára lehetővé tette akár az összes növényi hormon mennyiségének párhuzamos meghatározását ugyanazon mintában (11). Mindez azonban drága műszereket, speciális jól felszerelt laboratóriumot és megfelelő szakértelmet igényel.
A növényi hormonok funkcionális vizsgálatát nagyban elősegítették az in planta kimutatásukat lehetővé tevő molekuláris biológiai módszerek. Ezek többsége hormonválasz gének promoterének egy jelző (riporter) génhez való kapcsolásán alapszik (9,12). A leggyakrabban használt jelző gének termékei a bakteriális -glukuronidáz enzim (GUS), ami megfelelő szubsztrátokat használva kék vagy lila elszíneződést eredményez, illetve a medúzából származó zölden fluoreszkáló fehérje (GFP) és variánsai, melyek UV fénnyel detektálhatók. A hormon-indukált promóterrel kapcsolt riporter gént tartalmazó mesterséges gén konstrukciókat genetikai transzformációval beépítik a vizsgálni kívánt növény genomjába. A transzgenikus növényben a riporter gén működése, mint bioszenzor, jelzi a
103 hormon jelenlétét és a hormonválasz mértékét. Ez a módszer tehát nem közvetlenül a hormonnak az adott sejtben/szövetben való szintjéről ad információt, hanem a hormon koncentrációjának és a sejt/szövet hormon érzékenységének eredőjeként megnyilvánuló hormonhatásról. Előnye, hogy lehetővé teszi az in vivo hormonális változások térbeli és időbeli nyomon követését. Felhasználását korlátozzák ugyanakkor a transzgenikus növények létrehozásának nehézségei (időigény, faj és genotípus függés, a beépülés helyének hatása a génkifejeződésre stb.).
Összefoglalás
1. A növényi hormonok kizárólagos feladata a növényi szervezet növekedésének,
egyedfejlődésének, fiziológiájának és a környezethez való alkalmazkodásának koordinálása.
Azokat a jelátvitelben is szerepet játszó molekulákat, melyek más alapvető (pl. anyagcsere) funkcióval is rendelkeznek, nem soroljuk a hormonok közé.
2. A jelenleg az alábbi vegyületeket soroljuk a növényi hormonok közé: auxinok, citokininek, gibberellinek, abszcizinsav, etilén, brasszinoszteroidok, szalicilsav, jázmonsav, strigolakton, és a peptid hormonok.
3. Az állati és a növényi hormonok eltérnek egymástól. A növényi hormonokra jellemző:
i. kis szerves molekulák
b. nem speciális szervekben szintetizálódnak, hanem a szervezetben szinte bárhol képződhetnek
c. nincsenek speciális célsejtjeik, hatásuk szerteágazó
d. rövid és hosszútávú transzportjuknak köszönhetően nemcsak képződésük helyén hatnak, hanem távolabbi régiókba is eljuthatnak
e. nem állnak központi szabályozás alatt, hanem a környezeti tényezők és az
egyedfejlődési program függvényében kölcsönösen szabályozzák egymás szintjét és jelátvitelét
4. Az aktív növényi hormonok szintjét egy adott sejtben/szövetben/szervben a szintézisük és lebontásuk aránya, szerkezeti módosulások (egymásba reverzibilisen vagy irreverzibilisen átalakulni képes aktív, illetve inaktív variánsok), illetve a transzport folyamatok szabják meg.
5. A növényi hormonok elsődleges (pl. aminosav, illetve zsírsav szintézis) illetve másodlagos (terpenoid bioszintézis) anyagcsere utak módosulásának/elágazásának termékei.
6. A növényi hormonok érzékelésében specifikus sejtfelszíni és/vagy intracelluláris receptorok vesznek részt. A jelátvitel fehérje foszforiláció és/vagy fehérje ubikvitináció és lebontás függő.
7. A növényi hormonok kimutatása és mennyiségi meghatározása a komplex növényi mintákban biológiai hatásukon (bioesszék, bioszenzorok), illetve kémiai szerkezetükön és fiziko-kémiai tulajdonságaikon (immunológiai és kromatográfiás eljárások) alapul. A modern tömegspektrográfiai eljárások lehetővé teszik az igen kis mennyiségben előforduló növényi hormonok és szerkezeti variánsaik egymás melletti kvantitatív kimutatását korlátozott mennyiségű növényi mintából is.
104 Ellenőrző kérdések
1. Melyek a ma ismert növényi hormonok?
2. Miért nem tekintjük növényi hormonnak a nitrogén monoxidot?
3. Miért sorolhatjuk a jelátviteli szerepű peptideket a növényi hormonok közé?
4. Mik a növényi és állati hormonok közötti legfontosabb általános különbségek?
5. Melyik az a másodlagos anyagcsere útvonal, amelyhez számos növényi hormon szintézise kapcsolódik?
6. Mely aminosavak szolgálnak növényi hormon szintézisének kiindulási anyagául?
7. Milyen folyamatok befolyásolják egy hormon szintjét egy adott szövetben?
8. Hol történik az egyes növényi hormonok érzékelése?
9. Mi az a két általános jelátviteli folyamat, amely a növényi hormonok jelátvitelében fontos szerepet játszik?
Megvitatandó kérdések
1. Miért térnek el ennyire a növényi és állati hormonok?
2. Ha a növényekben a hormonok nem állnak központi (idegrendszeri) szabályozás alatt, hogyan történik a szervezet fejlődésének/reakciójának a koordinálása?
3. Mi lehet az oka, illetve előnye annak, hogy több növényi hormon jelátvitele transzkripciót gátló fehérje lebontásán alapszik?
4. Miért fontos a növényi hormonok kutatása?
5. Milyen tényezőktől függ egy adott sejt hormonválasza?
Javasolt irodalom
1. Erdei László (szerk.). Növényélettan – Növekedés- és fejlődésélettan. JATEPress Szeged, Magyarország, 2011.
2. Li J, Li C, Smith SM. (szerk.) Hormone Metabolism and Signaling in Plants. Academic Press;
2017.
3. Davies PJ, (szerk.) Plant Hormones: Biosynthesis, Signal Transduction, Action! 3. kiad.
Springer Netherlands; 2010.
Felhasznált irodalom
1. Masuda Y, Kamisaka S. Discovery of Auxin. In: Discoveries in Plant Biology (Internet). WORLD SCIENTIFIC; 2000 (idézi 2019. január 14.). o. 43–57. (Discoveries in Plant Biology; köt. Volume 3).
Elérhető: https://www.worldscientific.com/doi/abs/10.1142/9789812813503_0003 2. Smith SM, Li C, Li J. Hormone function in plants. In: Li J, Li C, Smith SM, szerkesztő. Hormone
metabolism and signalling in plants. Academic Press, United States of America; 2017. o. 1–32.
3. Qin G, Gu H, Zhao Y. An indole-3-acetic acid carboxyl methyltransferase regulates Arabidopsis leaf development. Plant Cell. 2005; 17:2693–704.
4. Feng J, Shi Y, Yang S. Cytokinins. In: Hormone Metabolism and Signalling in Plants. Academic Press, United States of America; 2017.
105 5. Wang B, Wang Y, Li J. Strigolactones. In: Hormone Metabolism and Signaling in Plants (Internet).
Elsevier; 2017 (idézi 2019. január 3.). o. 327–59. Elérhető:
https://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/B9780128115626000104
6. Larrieu A, Vernoux T. Comparison of plant hormone signalling systems. Essays Biochem. 2015.
szeptember 15.;58(0):165–81.
7. Brenner M. Modern methods for plant growth substance analysis. Ann Rev Plant Physiol. 1981;
32:511–38.
8. Du F, Ruan G, Liu H. Analytical methods for tracing plant hormones. Anal Bioanal Chem. 2012;
403:55–74.
9. Su Y, Xia S, Wang R, Xiao L. Phytohormonal quantification based on biological principles. In:
Hormone Metabolism and Signaling in Plants. 2017. o. 431–70.
10. Chu J, Fang S, Xin P. Quantitative analysis of plant hormones based on LC-MS/. In: Hormone Metabolism and Signalling in Plants. Academic Press, United States of America; 2017. o. 471–
526.
11.Durgbanshi A, Arbona V, Pozo O. Simultaneous determination of multiple phytohormones in plant extracts by liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry. J Agric Food Chem. 2005; 53:8437–42.
12. Wells D, Laplaze L, Bennett M. Biosensors for phytohormone quantification: challenges, solutions, and opportunities. Trends Plant Sci. 2013; 18:244–9.
106