Kétdimenziós elektroforézis 1. Mintaelőkészítés

A QMY23 és a cappz1 deléciós mutáns Candida albicans törzseket tartalmazó mintákat proteáz és foszfatáz inhibitorokat tartalmazó sejtlizátumok formájában kaptuk meg kollaborációs partnerünktől (Prof. Dombrádi Viktor, DE ÁOK Orvosi Vegytani Intézet). A sejtlizátumok fehérje koncentrációját Bradford módszerrel határoztuk meg, majd 450 μg-nyi fehérjét tartalmazó mintát Ready-Prep CleanUp Kit (Bio-Rad) segítségével tisztítottunk a gyártó utasításainak megfelelően. A tisztítás során történő fehérje kicsapás és centrifugálás után a mosott fehérjéket tartalmazó csapadékot 450 μl 7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 1% DTT, 2 % Bio-Lyte (Bio-Rad) és 0,001% brómfenolkék tartalmú rehidráló oldatban oldottuk fel és azonnal 24 cm-es pH 4-7 immobilizált pH gradiensű fókuszáló gélre (Bio-Rad) vittük fel, és elkezdtük a passzív rehidrálást.

Az egér üvegtesti mintákat a kollaborációs partnerünk (Dr. Petrovszki Goran, ÁOK Szemklinika) által történő üvegtest izolálása után azonnal 7 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS és 30 mM Tris-HCl tartalmú pufferbe tettük, pipettával szuszpendáltuk, majd jégen

szonikáltuk 5 percig. Ez után egy centrifugálás segítségével (500xg, 4^oC, 10 min) megszabadultunk a sejttörmeléktől és a felülúszót Ready-Prep CleanUp Kit segítségével tisztítottuk az előzőekben ismertetett módon. A mintákat 24 cm-es pH 3-10 immobilizált pH gradiensű fókuszáló gélre (Bio-Rad) vittük fel, majd passzív rehidrálással juttattuk a gélbe.

4.7.2. Izoelektromos fókuszálás

A kétdimenziós elektroforézis első dimenziójához, az izoelektromos fókuszáláshoz a 450 μl mintát passzív rehidrálással, 20 ^oC-on egy éjszakán át jutattuk az immobilizált pH gradienst tartalmazó fókuszáló gélekre. Másnap reggel, a mintába kevert brómfenolkék által biztosított kék szín egyenletes eloszlásának és a fókuszáló gél térfogatának megnövekedésének megfigyelése után a fókuszáló géleket izoelektromos fókuszáló készülékbe (Bio-Rad) helyeztük és ásványi olajat rétegeztünk rá. Az izoelektromos fókuszálást a következő beállításokkal végeztük el: 300 V feszültséggel 3 órán át sómentesítettük a mintát, majd fokozatosan, 5 óra alatt a feszültséget 3500 V-ra emeltük, és 3500 V-on tartottuk 18 órán át. A fókuszálást követően a géleket -70 ^oC-on tároltuk az ekvilibrálásig.

4.7.3. Ekvilibrálás

A -70 ^oC-ról kivett géleket frissen elkészített, 500 mM Tris-HCl (pH 8,5), 6 M urea, 2% SDS, 20% glicerol és brómfenolkék tartalmú ekvilibráló pufferben ekvilibráltuk. Az ekvilibrálás első lépésében a pufferhez 0,6% DTT-t adtunk, aminek hatására megtörtént a diszulfid hidak redukálása. Az ekvilibrálás második lépésében lecseréltük az oldatot és az ekvilibráló pufferhez 1,2% jódacetamidot adtunk annak érdekében, hogy az előző lépésben redukált tiol csoportokat alkiláljuk. Az ekvilibrálás mindkét lépése egyenként 15 percig tartott, miközben az egyenletes keverés érdekében billenő asztalon lassan billegtettük a géleket.

4.7.4. SDS-poliakrilamid gélelektroforézis

A második dimenzióhoz 12%-os SDS-poliakrilamid gélt öntöttünk. Tekintve, hogy a keratinszennyezés ebben a lépésben már lényeges problémát jelenthet, különös figyelmet fordítottunk a tisztaságra. Az asztalfelületet, valamint a gélöntéshez használt üveglapokat és eszközöket tömény etanollal átitatott szöszmentes kendővel alaposan áttöröltük. Ez után a 24 cm-es géllapok aljára kb. 1 cm magas akrilamid gélcsíkot öntöttünk, majd ennek megszilárdulása után készítettük el és öntöttük rá a gél többi részét. A gélöntés két lépésben

való elvégzésére azért volt szükség, mert a gél nagy tömege miatt a megszilárdulás előtt egy része elfolyt volna az illesztéseknél. A gélek tetejére vizet rétegeztünk, hogy biztosítsuk az egyenletes gélfelületet. A megszilárdulás után (kb. 40 perc) a vizet leöntöttük a gélek tetejéről, szöszmentes szűrőpapírral leitattuk és azonnal ráhelyeztük az ekvilibrált izoelektromos fókuszáló géleket, és egy megfelelően kiképzett spatula segítségével óvatosan rányomtunk az SDS-poliakrilamid gélek tetejére. Vigyáztunk, hogy ne sértsük meg a gél felszíneket, majd brómfenolkékkel színezett alacsony olvadáspontú agarózt rétegeztünk rá annak érdekében, hogy légmentesen lezárjuk a két gél közötti részt. A gélek tetejére rétegzett agaróz megszilárdulása után a géleket tartalmazó üveglap-szendvicseket Protean Plus Dodeca Cell (Bio-Rad) elektroforézis futtatókádba helyeztük. A kád egyszerre 12 gél elektroforézisét teszi lehetővé, így az egy analízishez szükséges összes párhuzamos elektroforézise egyidejűleg volt lehetséges.

Az elektroforézist 100 mA konstans áramerősséggel végeztük kb. 24 órán át, amíg a brómfenolkék elérte a gélek alját.

Az elektroforézis után az üveglap-szendvicseket szétszedtük és a géleket előre elkészített, feliratozott puffert tartalmazó jól zárható fedelű edényekbe helyeztük.

4.7.5. Gélek festése

A gélek festéséhez kétféle fluoreszcens festéket alkalmaztunk. A házilag készített RuBPS festék [13] az összes fehérjét megfesti, míg a ProQ Diamond (Thermo Life Technologies) festék csak a foszforilált fehérjékhez kötődik, így csak azok válnak detektálhatóvá.

ProQ Diamond festés

A festést fixálással kezdtük, amely megakadályozta a fehérjék diffundálását a gélben az elektroforézis után. A fixáláshoz 10% ecetsav, 50% metanol oldatot használtunk és 2x30 percig fixáltuk a géleket. A fixálás után 3-szor mostuk nagy tisztaságú MilliQ vízzel a géleket, majd ráöntöttük a festéket és egy éjszakán át 20^oC-on billegtettük. Másnap reggel a géleket áttettük ProQ Diamond Destain oldatba és 3x30 percig, majd MilliQ vízben 2x5 percig mostuk a géleket.

RuBPS festés

A festés ebben az esetben is a fixálással kezdődött, amelynek során a géleket 10%

ecetsav, 50% metanol elegyében áztattuk 2 órán át, majd a géleket 20% etanolt és 100 nM RuBPS-t tartalmazó oldatba helyeztük, és egy éjszakán át 20^oC-on, sötétben billegtettük.

Másnap reggel a géleket áttettük 7% ecetsav, 10% metanol oldatába, annak érdekében, hogy

a nem kötődött festékszemcséket eltávolítsuk, majd MilliQ vízben 3x30 percig mostuk a géleket.

4.7.6. Géldokumentáció és gélkép analízis

A géldokumentáció Pharos FXPlus Molecular Imager (Bio-Rad) szkennerrel történt a következő beállításokkal: excitáció: 532 nm-en, szkennelés 615 nm-en, 100 μm felbontással.

A gélképek analízisét a Delta 2D 4.4 szoftver (Decodon) segítségével végeztük. A szkenner által készített képek tiff formátumát betöltöttük a Delta 2D szoftverbe, ahol létrehoztuk a kísérleti elrendezésnek megfelelő csoportokat. Az egyes csoportokba tartozó géleken levő foltokat egymásra vetítettük a szoftver által biztosított „exact mode matching protocol” és

„group warping strategy” beállítások segítségével. A „union mode” segítségével egy egyesített gélképet hoztunk létre (fused image), amely az összes foltot tartalmazta. A továbbiakban a foltok detektálása ezen az egyesített gélképen történt, majd a szoftver a foltok körberajzolásával nyert folt területeket visszavetítette az egyes gélekre, és ezeket a területeket - pontosabban az ezekhez a területekhez tartozó intenzitás értékeket - használta fel a mennyiségi analízis elvégzéséhez. A kvantitálás úgy történt, hogy a szoftver az összes detektált folt intenzitásának az összegét 100%-nak minősítette, majd az egyes géleken levő foltok intenzitását az összes intenzitás százalékaként tüntette fel és normalizált térfogatnak nevezte el. Az egyes csoportokhoz tartozó géleken mért átlagos normalizált folt-térfogatokat összevetettük, és a szoftver által elvégzett Student t-tesztben szignifikáns változást mutató értékekhez tartozó foltokat kivágtuk. A kivágott foltokban levő fehérjéket MS/MS-alapú tömegspektrometriás fehérje azonosítás segítségével azonosítottuk.

4.8. SDS-poliakrilamid gélelektroforézis

20 μg totál protein tartalmú, előzőleg 4% SDS, 20% glicerol, 10% beta-merkaptoetanol, 0,02% brómfenolkék tartalmú 0,125 M Tris-HCl, pH 6.8 oldatban elfőzött és lehűtött könnyminták fehérje tartalmát vizsgáltuk. Az elválasztás 10%-os SDS-poliakrilamid gélen történt Bio-Rad mini tetra cell (Bio-Rad) elválasztó egységben 100 A konstans áramerősséggel 1 órán át. A gélfestéshez Coomassie PageBlue (Fermentas) oldatot használtunk a gyártó utasításainak megfelelően, és a gélképet Pharos FX Plus lézer szkenner (Bio-Rad) segítségével rögzítettük. A gélkép analízisét a QuantityOne szoftver (Bio-Rad) segítségével végeztük, így határoztuk meg az egyes sávok intenzitását.