5. EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉSÜK
5.1. A Candida albicans PPZ1 szerepének vizsgálata kétdimenziós elektroforézis segítségével
Annak érdekében, hogy több információt nyerjünk arról, hogy a cappz1 gén terméke hogyan fejti ki biológiai hatását, kétdimeziós elektroforézis segítségével megvizsgáltuk a C.
albicans proteómját és foszfoproteómját kontroll (QMY23) és cappz1 hiányos (cappz1) törzsekben. Arra voltunk kíváncsiak, hogy milyen változások tapasztalhatók a C. albicans proteómjában a CaPpz1 protein hiányában. Tekintve, hogy a genomból eltávolított enzim egy foszfatáz, a foszforilációs állapot változását is megvizsgáltuk. Csoportonként három biológiai párhuzamossal dolgoztunk, és a foltok kivágásának megkönnyítésére egy preparatív Mix mintát is létrehoztunk, amelyet a kontroll és foszfatáz hiányos minták 1:1 arányú összekeverésével nyertünk.
A gélképek analízise során a 2. ábrán bemutatott protokollt használtuk. Először összehasonlítottuk a ProQ Diamonddal festett, foszforilált fehérjéket megjelenítő foltokat a kontroll és a mutáns törzsek esetében, ezután a ProQ Diamonddal festett géleket RuBPS-el újra festettük. A foszforilált fehérjék esetében végzett összehasonlítást elvégeztük a RuBPS-el festett géleken is, utána a géleket a Mix RuBPS-elnevezésű, RuBPS-RuBPS-el festett preparatív gélekkRuBPS-el hasonlítottuk össze annak érdekében, hogy a különbséget mutató foltokat pontosan beazonosíthassuk a Mix gélen, majd kivághassuk további elemzés céljából.
Tekintve, hogy a Mix gélek a mutáns és kontroll törzsek lizátumának 1:1 arányú keverékét tartalmazták, biztosították mindegyik vizsgált folt jelenlétét, így egyértelművé téve a foltok beazonosítását.
2. ábra. A kontroll és mutáns C. albicans törzsek elemzésekor alkalmazott stratégia.
A foszfoproteóm változásait tanulmányozva a ProQ Diamond festékkel megfestett gélek gélképét elemeztük. A kontroll és cappz1 deléciós mutánst tartalmazó gélképekből létrehozott egyesített gélkép 473 foltot tartalmazott, amelyből 41 folt mutatott statisztikailag szignifikáns eltérést a kontroll és deléciós mutáns csoportok között (3. ábra).
A 41 foltot kivágtuk a Mix gélből, és fehérje analízisnek vetettük alá, de csak 27 folt esetében tudtunk a mintákban fehérjét azonosítani (1. táblázat). A (9), (15), (25) és (35) foltokban nem csak egy fehérjére jellemző szekvenciát azonosítottunk, ezért ezeket kizártuk a további elemzésekből.
3. ábra. A kontroll és mutáns törzsekből származó minták kétdimenziós elektroforézisével elválasztott, ProQ Diamond-al festett, foszforilált fehérjéket
megjelenítő gélképekből nyert egyesített gélkép.
A számok azokat a foltokat mutatják, amelyek intenzitása statisztikailag szignifikáns módon különbözött a kontroll és mutáns gélképek között. A P elnevezés a ProQ Diamond festésre utal. A *-al jelölt foltok esetében nem csak egy fehérjét azonosítottunk az adott foltban, ezért
ezeket kizártuk a további elemzésekből (l. szöveg).
1. táblázat. A CaPpz1 hiányában statisztikailag szignifikáns módon megváltozott intenzitású, ProQ Diamond-al festett foltokban azonosított foszforilált fehérjék
Folt
dehidrogenáz A0A1D8PJK5 AIP2 Aip1 -2,05 0,026
27 Elongációs faktor
36
hidroxiláz* Q59Z14 C2_07290W Lia1-szerű**
A táblázatban a foltok száma mellett az egyes foltokban tömegspektrométer segítségével azonosított fehérjék neve, a fehérje azonosítója, a génnév, a fehérje rövidítése, az intenzitás változás mértéke a kontrollhoz képest és a p érték van feltüntetve. A fehérje- és génneveket a UniProt adatbázis és a http://www.candidagenome.org/ alapján állapítottuk meg. A * arra utal,
hogy ugyanazt a fehérjét két különböző foltban is azonosítottuk. A **-al jelölt neveket az S.
cerevisiae ortológ neve alapján adtuk meg.
A Lia1-szerű, Rpp0, és Uba1 fehérjék mindegyike két foltban volt megtalálható, így összesen 20 egyedi fehérjét tudtunk azonosítani, amelyek foszforilációja statisztikailag szignifikáns módon változott meg a cappz1 deléció hatására. A várakozásoknak megfelelően, a foszfatáz hiányában bizonyos fehérjék, mint a Dug 1-szerű fehérje, Eft2, Rad23, Rpp0, és Tkl1 esetében a foszforiláció növekedett. Az Uba1 fehérje esetében egy érdekes jelenséget figyelhettünk meg, ugyanis a foszforiláció mértéke növekedett a (30) foltban és ugyanakkor
csökkent a (31) foltban. Tekintve, hogy ezek a foltok többé-kevésbé azonos móltömeggel, de eltérő töltéssel rendelkező fehérjéket tartalmaznak (3. ábra), feltehetően ugyanannak a fehérjének a hiper-, ill. hipofoszforilált formáival állunk szemben. A többi 14 fehérje esetében a foszforiláció csökkent a CaPpz1 hiányában, ami egyéb indirekt hatásokra, vagy okokra utal.
A ProQ Diamonddal festett gélek elemzése után a gélekre RuBPS-el ráfestettünk. A kontroll és mutáns törzsekből származó kétdimenziós elektroforézissel elválasztott fehérjéket RuBPS festéssel megjelenítő gélképekből nyert egyesített gélképen 519 foltot detektáltunk (4. ábra), amelyből 52 mutatott statisztikailag szignifikáns eltérést a két csoport között. A több mint 1,5-szörös különbséget mutató 20 foltot kivágtuk a Mix gélből, a bennük lévő fehérjéket tripszinnel megemésztettük, majd tömegspektrometriás fehérjeazonosítást végeztünk.
4. ábra. A kontroll és mutáns törzsekből származó minták kétdimenziós
elektroforézisével elválasztott, RuBPS-el festett, összes fehérjét megjelenítő gélképekből nyert egyesített gélkép.
A számok azokat a foltokat mutatják, amelyek intenzitása statisztikailag szignifikáns módon különbözött a kontroll és mutáns gélképek között. Az R elnevezés a RuBPS festésre utal. A
*-al jelölt foltok esetében nem csak egy fehérjét azonosítottunk az adott foltban, ezért ezeket kizártuk a további elemzésekből. Azoknak a foltoknak, amelyek a ProQ Diamond festéssel is statisztikailag szignifikáns változást mutattak, a ProQ Diamond festéssel megállapított folt számát adtuk. Mivel nem minden szignifikáns foszforilációs változást mutató folt esetében detektáltunk a fehérje szinten is statisztikailag szignifikáns különbséget, ezért a számozás
nem folytonos.
A fehérje azonosítás 15 folt esetében volt sikeres, ezekben a foltokban 14 fehérjét sikerült azonosítani, ugyanis a Cef3 elongációs faktor két foltban (27) és (44) is jelen volt (2.
táblázat).
2. táblázat. A CaPpz1 hiányában statisztikailag szignifikáns módon megváltozott intenzitású, RuBPS-el festett foltokban azonosított fehérjék
Folt
hidroxiláz Q59Z14 C2_07290W Lia1-
szerű** -1,59 0,019
A táblázatban a foltok száma mellett az egyes foltokban tömegspektrométer segítségével azonosított fehérjék neve, a fehérje azonosítója, a génnév, a fehérje rövidítése, az intenzitás változás mértéke a kontrollhoz képest és a p érték van feltüntetve. A fehérje- és génneveket a UniProt adatbázis és a http://www.candidagenome.org/ alapján állapítottuk meg. A * arra utal,
hogy ugyanazt a fehérjét két különböző foltban is azonosítottuk. A **-al jelölt nevet az S.
cerevisiae ortológ neve alapján adtuk meg.
Megfigyeléseink szerint az Ade12, Idh1, Tkl1, Uba1 és Ure2 mennyisége növekedett a cappz1 deléció hatására, míg a Bmh1, Cef3, Crp3, Efb1, Hsp70, Lia 1-like, Rpl20B, Tsa1 és Yst1 mennyisége csökkent.
Összesen tehát 25 olyan fehérjét sikerült azonosítani, amely mennyisége vagy foszforilációja (vagy mindkettő) statisztikailag szignifikáns változást mutatott a CaPpz1 hiányában. A foszfoproteineket megfestő festék segítségével megjelenített foszforilációban megfigyelt változásokat több okra vezethetjük vissza:
1) a foszforilációban nem történik változás, de a fehérje mennyiségében igen,
2) a fehérje mennyiségében nem történik változás, és a megfigyelt változás a foszforiláció megváltozott mértékének tudható be, vagy
3) változás történik mind a fehérje mennyiségében, mind a foszforilációjában.
Ahhoz, hogy a megfigyelt foszforilációs változások mögött meghúzódó folyamatokat megismerjük, összevetettük a foszforilációs profil és a fehérje mennyiségek változásait (3.
táblázat).
3. táblázat. A CaPpz1 hiányában statisztikailag szignifikáns módon megváltozott intenzitású foltokban azonosított fehérjék csoportosítása
Fehérje Folt száma
RuBPS festés ProQ Diamond festés Változás
mértéke p érték Változás
mértéke p érték I. csoport
Ade12 46 2,60 0,04 NA -
Bmh1 47 -1,97 0,01 NA -
Efb1 43 -2,37 0,00 NA -
Idh1 45 2,76 0,02 NA -
Ure2 48 1,95 0,0004 NA -
II. csoport
Cef3* 44 -7,08 0,004 NA -
27 -3,63 0,02 -2,38 0,008
Cpr3 2 -2,20 0,01 -2,59 0,018
Hsp70/Ssa1 32 -1,52 0,04 -3,32 0,024
Rpl20B 10 -2,21 0,02 -4,81 0,019
Tkl1 29 1,84 0,01 1,78 0,045
Tsa1 16 -2,23 0,002 -2,18 0,028
Yst1 22 -2,35 0,04 -2,79 0,04 III. csoport
Aip2 34 -1,25 0,51 -2,05 0,03
Cyp5 7 -2,62 0,09 -2,02 0,0003
Dug1-like 36 -1,25 0,51 1,37 0,008
Eft2 28 -1,11 0,69 2,79 0,008
Guk1 3 -1,84 0,13 -4,57 0,003
Ham1 1 1,34 0,46 -2,79 0,03
Rad23 39 -1,24 0,37 1,95 0,006
Rpl9B 13 -1,69 0,19 -3,23 0,049
Rpp0 20 1,74 0,15 2,56 0,046
21 -1,08 0,82 2,63 0,005
Rps7A 4 -4,98 0,12 -2,58 0,047
Tif1 23 1,09 0,77 -2,05 0,014
IV. csoport
Lia1- szerű* 17 -1,06 0,75 -3,09 0,02
18 -1,59 0,02 -2,32 0,008
Uba1* 30 1,59 0,03 1,90 0,006
31 1,20 0,56 -2,31 0,04
A foltokban azonosított fehérjék esetében a fehérjék száma mellett a kontrollhoz képest meghatározott intenzitás változás mértéke a RuBPS-el ill. a ProQ Diamond-al festett géleken.
A változás mértéke mellett a p érték is fel van feltüntetve. A * arra utal, hogy az adott fehérjét két különböző foltban is azonosítottuk. A vastagon szedett számok a statisztikailag
szignifikáns mértékű változást jelzik. NA – nincs adat.
Az összehasonlítás eredményeként négy csoportot tudtunk elkülöníteni:
I. csoport: azokat a fehérjéket soroltuk ide, amelyek mennyiségében változás történt, de a foszforilációjuk nem volt kimutatható;
II. csoport: azokat a fehérjéket soroltuk ide, ahol mind a fehérje mennyiségben, mind a foszforiláció mértékében történt változás;
III. csoport: azokat a fehérjéket soroltuk ide, ahol a fehérje mennyisége nem változott, viszont a foszforiláció igen;
IV. csoport: azokat a fehérjéket soroltuk ide, ahol a fehérje két foltban is kimutatható volt, de a változás a két foltban nem egy irányba mutatott.
Ez utóbbi csoportba a Lia 1-szerű és az Uba1 fehérjét soroltuk. A Lia 1-szerű fehérje a (17) és (18) foltokban volt kimutatható. Mindkét foltban szignifikáns csökkenést mutatott a foszforilációja, viszont csak a (18) foltban mutatott szignifikáns csökkenést a fehérje
mennyisége. Az Uba1 fehérje mennyisége és foszforilációja szignifikáns növekedést mutatott a (30) foltban, ezzel szemben nem mutatott szignifikáns változást a fehérje mennyiségében a (31) foltban, ugyanakkor a foszforilációban szignifikáns csökkenést tapasztaltunk.
A IV. csoportba sorolt fehérjék különböző foltokban tapasztalt eltérő viselkedésére feltehetően az a magyarázat, hogy különböző proteoformákat sikerült detektálni az egyes foltokban, amelyek eltérő módon szabályzódnak.
Kollaborációs partnerünk elvégezte az azonosított fehérjék génexpressziós szintű vizsgálatát, és azt találta, hogy a Cef3 és Rps7A fehérjék kivételével, ahol a deléció hatására növekedett a génexpresszió, nem volt statisztikailag szignifikáns a változás.
Elvégeztük a fehérjék funkcionális elemzését és az eredmények a 5. ábrán illetve a 4.
táblázatban láthatók.
5. ábra. A CaPpz1 hiányában megváltozott mennyiségi vagy foszforiláltsági állapotú fehérjék.
A fehérjék GO szerinti funkcióját színkóddal jelöltük: a kék szín a fehérje szintézis vagy degradációban résztvevő fehérjéket, a fekete a morfológiai szereppel bíró fehérjéket, míg a
piros az oxidatív stress, és a zöld a metabolizmusban szerepet játszó fehérjéket jelöli. A fekete nyílak a fehérje mennyiségi változásait, a piros pedig a foszforiláltsági állapot
változásait mutatják. A * arra utal, hogy a jelzett fehérjét két különböző foltban is azonosítottuk. A két azonos színű nyíl a két különálló foltban észlelt változás irányát mutatja.
A fehérjék majdnem fele (12 fehérje) a fehérje szintézisben (1 transzkripciós iniciációs faktor, 3 transzlációs elongációs faktor, 5 riboszómális fehérje, 3 chaperon), kettő pedig a fehérjék proteoszómában történő degradációjában játszik szerepet. A fehérje szintézisben
szereppel bíró fehérjék mennyisége csökkent, míg az ubikvitin aktiváló enzim 1 (Uba1) mennyisége nőtt a deléciós mutáns C. albicans mintákban.
4. táblázat. A CaPpz1 deléció hatására változást mutató fehérjék funkcionális elemzése C. albicans
szintetáz Ade12 adeniloszukcinát szintetáz aktivitás, de novo AMP bioszintézis, biofilm
Bmh1 14-3-3 protein
homológ Bmh2 foszfoszerin kötés, DNS replikációs origó kötés, Spider biofilm
Idh1 izocitrát dehidrogenáz (NAD+) aktivitás, szolubilis fehérje a hifában
3 Yef3 transzlációs elongációs faktor aktivitás, ATPáz aktivitás
SSA1 Ssa4 chaperon, fel nem tekeredett fehérje kötése, Spider biofilm
Rpl20B 60S riboszómális
fehérje L20 Rpl20B riboszóma alkotó, transzláció, Spider biofilm
Tkl1 Transzketoláz 1 Tkl1
transzketoláz aktivitás, pentóz foszfát