A könny kémiai barrierjének vizsgálata és Alzheimer kór-specifikus potenciális könny biomarkerek azonosítása

Az Alzheimer kór etiológiája nem ismert pontosan, de főként a fejlett országok öregedő lakossága körében egyre gyakoribb az előfordulása, mely jelentős terheket ró a társadalom egészére [215]. Az Alzheimer kór során a szinapszisok száma jelentősen csökken és az agyban amiloid depozitumok jelennek meg. A betegség hátterében kimutatták a gyulladásos folyamatok és az oxidatív stressz jelentőségét [216–219].

Az Alzheimer kór az agyhoz hasonlóan a retinát is érinti. Amiloid lerakódásokat figyeltek meg Alzheimer kórban szenvedő betegek retinájában és lencséjében [220,221]. A betegségben csökkent a retina ganglion sejtjeinek a száma, elvékonyodott az idegsejtek

rétege, valamint a látóideg atrófiája és a nagyobb átmérőjű axonok számának csökkenése is megfigyelhető volt. Az érhálózatban és a retina morfológiájában bekövetkező változások alátámasztják az Alzheimer kórban szenvedő betegek rosszabb látását, a csökkent látásélességet, a fixáció nehézségeit, a színlátás és a kontraszt érzékelésének problémáit, illetve a szakkadikus szemmozgások késését [220–224]. A szemben levő elváltozások vizsgálata az egyik diagnosztikai lehetőség az Alzheimer kór nem invazív diagnózisára [220,223]. Az ilyen jellegű vizsgálatokhoz általában korszerű, sokszor igen drága műszerek és megfelelően képzett szakemberek szükségesek, amelyek nem állnak minden egészségügyi egység rendelkezésére. Annak érdekében, hogy egyszerűbb, betegágy mellett használható, vagy a beteg küldözgetése nélkül, háziorvosi rendelőben is megvalósítható vizsgálatot lehessen kifejleszteni, marker fehérjéket szerettünk volna azonosítani.

Tekintve, hogy a könny nem invazív módon gyűjthető, folyamatosan termelődő testfolyadék, és figyelembe véve a betegségre jellemző, szemet érintő elváltozásokat, munkánk során a könny fehérjéit, mint potenciális biomarker forrást vizsgáltuk meg azzal a céllal, hogy Alzheimer kórra jellemző potenciális biomarkereket azonosítsunk.

Vizsgálatainkat 14 beteg és 9 kontroll donor 37 mintájának analízisével kezdtük.

Először megvizsgáltuk a könnytermelődés sebességét, valamint a begyűjtött könny fehérje tartalmát (20. ábra).

20. ábra. A könnytermelés sebessége és a könny totál fehérje koncentrációja.

A könnyszekréció sebességét, ill. a könny teljes fehérje koncentrációját ábrázoltuk az „y”

tengelyen, míg az „x” tengelyen a csoportokat tüntettük fel. NAD a kontroll csoportra, AD az Alzheimer kórban szenvedők csoportjára vonatkozik. A * a statisztikailag szignifikáns

(p<0.05) különbséget mutatja.

A könny termelődési sebessége és a termelődött könny koncentrációja is nagyobb volt a betegek esetében a kontrollokhoz képest. Eredményeink szerint az Alzheimer kór hatására több és koncentráltabb könny termelődött. A könny összetételének és mennyiségének ilyen mértékű változása feltehetően a szemben Alzheimer kór során megfigyelt változásokkal áll összhangban [220–223]. Nincs adatunk az ok-okozati összefüggés megállapítására, viszont logikusnak tűnik, hogy a betegségben megfigyelt szemet érintő jelentős változások a könny termelés szintjén is tükröződjenek.

A következő lépésben a termelődött könny fehérje összetételét kívántuk megvizsgálni.

Ehhez három véletlenszerűen kiválasztott betegtől és két kontrolltól származó minta SDS-poliakrilamid gélelektroforézisét végeztük el. A festés után megjelenített sávok denzitometriás vizsgálata azt mutatta, hogy két sáv kivételével a betegektől származó mintákban a fehérje sávok intenzitása statisztikailag szignifikáns módon csökkent a kontrolloktól származó mintákban megfigyelt sávok intenzitásához képest (21. ábra).

21. ábra. Könnyminták vizsgálata SDS-PAGE segítségével.

A gélkép a 3 Alzheimer kórban szenvedő betegtől (AD) és a 2 korban illesztett kontrolltól (NAD) származó könnymintában elválasztott fehérje sávokat mutatja. Az oszlopdiagram „y”

tengelyén a gélkép bal oldalán levő számozás alapján elnevezett sávok („x” tengely) intenzitását ábrázoltuk. Szürkével a kontrolloktól (NAD), míg feketével az Alzheimer kórban

szenvedőktől származó minták elemzése során kapott értékeket ábrázoltuk. A * a statisztikailag szignifikáns (p<0.05) különbséget mutatja.

A sávokat kivágtuk, majd tömegspektrometriás fehérje azonosításnak vetettük alá. Az azonosított fehérjék (7. táblázat) funkcióját megvizsgálva azt találtuk, hogy főként a kémiai barrier felépítésében vesznek részt [214].

A fehérjék közül kiválasztottuk a laktotranszferrin, lizozim, Zn-alfa-2 glikoprotein, lipokalin A, prolaktin indukált fehérje, Ig λ lánc C régió, lakritin és lipofilin-1 fehérjéket, valamint

hozzátettük a dermcidint és galektin-3 kötő fehérjét mint további kémiai barrier komponenseket. A kiválasztott 10 fehérjére MRM/SRM-alapú célzott proteomikai módszert terveztünk és optimalizáltunk, majd az optimalizált paramétereket (Függelék 1. táblázat) felhasználva elvégeztük a célzott proteomikai analíziseket 37 könnymintán.

7. táblázat. A gél sávokban levő fehérjék azonosítása MS/MS spektrumok alapján

Sávok

száma Azonosított fehérje Génnév

Azonosításhoz

Immunglobulin alfa-1 lánc IGHA1 3

Laktotranszferrin LTF 3

6 Laktotranszferrin LTF 2

Immunglobulin alfa-1 lánc IGHA1 2

7

Lakritin LACRT 4

Zn-alfa2-glikoprotein AZGP1 13

Keratin 1 KRT1 3

8 Keratin 1 KRT1 5

Keratin 10 KRT10 3

9 Immunglobulin lambda lánc IGLC 2

10

Immunglobulin lambda lánc IGLC 3

Immunglobulin kappa lánc IGKC 6

Zimogén granulum protein 16 homológ ZG16B 5

Prolin gazdag fehérje 4 PRR4 3

A táblázatban az egyes sávokban azonosított fehérjék nevét, az azonosításhoz felhasznált peptidek számát és az azonosított fehérjék génnevét tüntettük fel.

Az MRM/SRM analízissel nyert eredményeket statisztikai elemzésnek vetettük alá, és hat fehérje esetében tapasztaltunk statisztikailag szignifikáns változást a betegség hatására (22.

ábra).

22. ábra. Az MRM/SRM-alapú célzott proteomikai módszerrel történő könnyfehérje kvantitálás.

Az „x” tengelyen a beteg és a kontroll csoportok közötti változás mértékét (log2 skála) ábrázoltuk az „y” tengelyen megjelölt fehérjék esetében. A * a statisztikailag szignifikáns (p

< 0,05) különbségeket mutatja.

Eredményeink azt mutatják, hogy a könnymirigy által szekretált fehérjék, mint a lakritin, laktoferrin, lipokalin-1, prolaktin indukált fehérje és lizozim C [214] mennyisége statisztikailag szignifikáns módon csökken az Alzheimer kórban szenvedő betegek mintáiban, a korban és nemben illesztett kontrollok könnymintáihoz képest. Ugyanakkor az epitél eredetű dermcidin [145] mennyisége statisztikailag szignifikáns módon megnőtt a betegektől származó mintákban.

Az SDS-PAGE és a célzott tömegspektrometriával végzett kvantitálás eredményei egybevágnak, és a könnyfehérjék csökkenését mutatják a betegek mintáiban, ami ellentmond a totál fehérje mérés során kapott magasabb fehérje koncentrációknak. A dermcidin mennyisége nőtt, viszont a rendelkezésre álló adatok alapján nem tudjuk biztosan állítani, hogy a dermcidin, és a hozzá hasonló kisebb móltömegű peptidek magasabb mennyisége lehet-e felelős a megfigyelt jelenségért. Kísérleteinkben 10%-os akrilamid gélt használtunk, amely nem tudta megtartani a 4,7 kDa nagyságú dermcidint. Annak eldöntésére, hogy peptidek vagy más kis móltömegű fehérjék fokozott jelenléte, vagy esetleg teljesen más jelenség áll az általunk tapasztalt ellentmondás hátterében, további kísérletek szükségesek.

A neurodegeneratív betegségben szenvedőknél csökkent korneális érzékenységet és abnormális könny funkciókat írtak le [225], amit okozhat a könnymirigyek által termelt fehérjék csökkent szintje. Az alacsony könnymirigy eredetű AMP fehérje szintet feltehetően a magasabb dermcidin, és esetlegesen egyéb epitél eredetű, általunk nem vizsgált fehérjék mennyisége ellensúlyozza, így biztosítva a megfelelő antibakteriális védelmet az Alzheimer kórban szenvedő betegek esetében is.

Annak eldöntésére, hogy melyik potenciális biomarkert vagy biomarker kombinációt érdemes tovább vizsgálni, ROC (Receiver-Operator Characteristic) statisztikát végeztünk (8.

táblázat).

8. táblázat. Potenciális biomarkerek és biomarker kombinációk ROC analízise Potenciális biomarkerek és

Minden vizsgált potenciális biomarker és biomarker kombináció esetében feltüntettük a szenzitivitás, specificitás és AUC értékeket. A fehérjéket a génnevek segítségével jelöltük.

A ROC analízisben a 0,5 körüli AUC érték azt mutatja, hogy az illető marker a véletlennél nem teljesít jobban; az 1-hez közeli érték pedig nagyon jól teljesítő markert mutat. A 0,7 körüli AUC érték megfelelően teljesítő markerre utal. Gyakorlatilag mindegyik potenciális marker vagy marker kombináció 0,7 körüli AUC értéket mutatott. A szenzitivitást és specificitást is figyelembe véve az AUC értékek mellett, a legkiegyensúlyozottabb értékeket a lipokalin-1-t, dermcidint, lizozim C-t és lakritint tartalmazó kombináció mutatta 81%

szenzitivitással, 77% specificitással és 0,8 AUC értékkel.

Eredményeink egyrészt további bizonyítékot szolgáltattak a kémiai barrier változásaira kóros állapotokban és sikerült bizonyítani, hogy az Alzheimer kórban szenvedő betegek könnyében a kémiai barrier összetétele lényegesen eltér a korban és nemben illesztett kontrollok könnymintáiban megfigyelt kémiai barrier összetételéhez képest. Ugyanakkor a könnytermelődés sebességét, valamint a lakritin, lipokalin-1, lizozim C és dermcidin kombinációját figyelembe véve kísérleti adataink alapján a beteg és a kontroll csoport elkülöníthető egymástól. Amennyiben nagy mintaszámon is sikerül validálni az általunk azonosított potenciális biomarkereket, ki lehet fejleszteni egy könnyen használható gyorstesztet, amely segítségével a betegség diagnosztizálása felgyorsítható, a terápia hamarabb megkezdhető, és reményeink szerint a betegek életminősége javítható.

5.3.4. A szemben zajló sebgyógyulási folyamatok tanulmányozása, és olyan potenciális