C. albicans fehérje neve
5.3. A könnyben, nyálban, verejtékben levő kémiai barrier vizsgálata és potenciális biomarkerek azonosítása
5.3.5. A nyál kémiai barrierjének vizsgálata és szájüregi laphámrák-specifikus potenciális biomarkerek azonosítása
5.3.5.1. Az OSCC-re jellemző nyálfehérje profil vizsgálata
A nyálfehérjék tanulmányozására több módszert alkalmaztunk. Három OSCC-ben szenvedő beteg és három kontroll nyálmintáját jelölés nélküli kvantitálás segítségével vizsgáltuk azzal a céllal, hogy a betegségre jellemző fehérjéket azonosíthassunk. A nyálminták vizsgálatával több, mint 500 fehérjét sikerült azonosítani. Az azonosított fehérjék közül kiválogattuk azokat, amelyek legalább kétszeres mennyiségi változást mutattak a két csoport között (12. táblázat), és ezeket tovább vizsgáltuk. Szakirodalmi és tudományos adatbázisokban elhelyezett, szabadon hozzáférhető adatok alapján megvizsgáltuk a fehérjék funkcióját, illetve azt, hogy már azonosították-e korábban OSCC mintákban. Az OSCC-ben mások által azonosított fehérjék esetében azt is megvizsgáltuk, hogy milyen típusú mintában (nyál, szövet, szérum) találták meg eddig.
12. táblázat. A kontroll (CTL) és beteg (OSCC) csoportok között legalább kétszeres különbséggel kimutatott fehérjék listája
P01011 Alfa-1-antikimotripszin 3,29 0,27
akut fázis fehérje, nyálfehérje
proteáz inhibitor NA P01009 Alfa-1-antitripszin 3,70 0,10 nyálfehérje proteáz inhibitor nyál [336]
P04217 Alfa-1B-glikoprotein 3,25 0,00 nyálfehérje immunválasz nyál [329]
P02765 Alfa-2-HS-glikoprotein 2,70 0,01
akut fázis
P01023 Alfa-2-makroglobulin 2,16 0,01 nyálfehérje proteáz inhibitor NA P04745 Alfa-amiláz 1 0,21 0,05 nyálfehérje metabolikus
enzim nyál [330]
P01019 Angiotenzinogén 8,50 0,04
akut fázis
P01008 Antitrombin-III 2,08 0,41
akut fázis fehérje, nyálfehérje
proteáz inhibitor,
véralvadás NA
P02647 Apolipoprotein A-I 2,14 0,02 nyálfehérje lipid
metabolizmus nyál [335]
P02652 Apolipoprotein A-II 3,85 0,08 nyálfehérje lipid
metabolizmus nyál [335]
P06727 Apolipoprotein A-IV 3,55 0,07 nyálfehérje lipid
metabolizmus nyál [335]
P04114 Apolipoprotein B-100 8,12 0,00 nyálfehérje lipid
P02749 Beta-2-glikoprotein 1 3,02 0,09 nyálfehérje lipid
metabolizmus, véralvadás
nyál [333]
P61769 Beta-2-mikroglobulin 0,46 0,04 nyálfehérje immunválasz NA Q96DR5 BPI fold-tartalmú
fehérje A 2 0,49 0,02 nyálfehérje immunválasz,
védekezés NA
P00450 Cöruloplazmin 3,65 0,02
akut fázis fehérje, nyálfehérje
fém kötés vér [337]
P04080 Cisztatin-B 0,39 0,05 nyálfehérje proteáz inhibitor NA P01034 Cisztatin-C 0,33 0,02 nyálfehérje proteáz inhibitor NA P09228 Cisztatin-SA 0,35 0,02 nyálfehérje proteáz inhibitor nyál [330]
P99999 Citokróm c 0,00 0,12 akut fázis
Q02413 Dezmoglein-1 0,40 0,15 nyálfehérje dezmoszóma
komponens NA
Q01469 Epidermális
zsírsavkötő fehérje 0,49 0,20 nyálfehérje lipid
metabolizmus nyál* [335]
P61916 Epididimális
szekretoros fehérje E1 0,30 0,07 nyálfehérje lipid
B7ZLE5 FN1 protein 5,73 0,10 nyálfehérje sejtadhézió tumor szövet [340]
P00558 Foszfoglicerát kináz 1 0,44 0,13 nyálfehérje metabolikus
enzim nyál [333]
Q96G03 Foszfo-glukomutáz-2 0,40 0,23 nyálfehérje metabolikus
enzim NA
P36871 Foszfo-glukomutáz-1 0,08 0,14 nyálfehérje metabolikus
enzim NA
alegység 3,37 0,03 nyálfehérje oxigén transzport nyál* [335]
P68871 Hemoglobin béta
alegység 4,41 0,07 nyálfehérje oxigén transzport nyál* [335]
P02790 Hemopexin 2,41 0,00 akut fázis
fehérje, hem kötés nyál [329,333]
nyálfehérje
Q9Y6R7 IgGFc-kötő fehérje 0,49 0,65 nyálfehérje immunválasz NA P11215 Integrin alfa-M 2,01 0,54 nyálfehérje immunválasz tumor
szövet [342]
P19827 Inter-alfa-tripszin
inhibitor nehéz lánc H1 3,76 0,01 nyálfehérje proteáz inhibitor nyál [335]
P19823 Inter-alfa-tripszin
inhibitor nehéz lánc H2 11,23 0,02 nyálfehérje proteáz inhibitor nyál [335]
Q14624 Inter-alfa-tripszin
inhibitor nehéz lánc H4 5,33 0,03 nyálfehérje proteáz inhibitor nyál [335]
Q14CN2 Kalcium aktivált klorid
csatorna regulátor 4 0,23 0,21 nyálfehérje transzport NA P27482 Kalmodulin-szerű
fehérje 3 0,37 0,08 nyálfehérje fém kötés,
chaperon NA
P27797 Kalretikulin 0,37 0,39 nyálfehérje chaperon NA
Q9NQ38 Kazal típusú szerin
proteáz inhibitor 5 0,32 0,14 nyálfehérje lipid
metabolizmus NA
P02538 Keratin II 6A 0,44 0,31 nyálfehérje citoszkeleton NA P01042 Kininogén-1 2,89 0,00 nyálfehérje proteáz inhibitor,
véralvadás nyál [335]
P22528 Kornifin-B 0,45 0,24 nyálfehérje elszarusodás NA
P08185 Kortikoszteroid-kötő
P40926 Malát dehidrogenáz,
mitokondriális 0,37 0,24 nyálfehérje metabolikus
enzim NA
Q8TAX7 Mucin-7 0,00 0,15 nyálfehérje védekezés NA
P80303 Nucleobindin-2 0,32 0,06 nyálfehérje fém kötés nyál [335]
Q6UX06 Olfaktomedin-4 0,47 0,40 nyálfehérje sejtadhézió NA P36955 Pigment epitélium
eredetű faktor 7,17 0,18 nyálfehérje tumorfejlődés,
angiogenezis NA
P05155 Plazma proteáz C1
inhibitor 5,95 0,01 nyálfehérje proteáz inhibitor,
véralvadás NA
P02760 Protein AMBP 5,41 0,03 nyálfehérje proteáz inhibitor,
védekezés nyál [335]
O60888 Protein CutA 0,43 0,05 nyálfehérje fém kötés, enzim
kötés NA
P02753 Retinol-kötő fehérje 4 2,54 0,10 nyálfehérje proteáz inhibitor,
védekezés vér [341]
P02768 Szérum albumin 2,53 0,11 nyálfehérje transzport nyál [333]
P27169
fehérje méregtelenítés nyál [335]
Q6UWP8 Szuprabazin 0,05 0,05 nyálfehérje sejtproliferáció NA P62328 Timozin beta-4 0,42 0,20 nyálfehérje aktin kötés,
sejtproliferáció NA O60235 Transzmembrán
proteáz szerin 11D 0,20 0,06 nyálfehérje proteáz,
védekezés NA
P68363 Tubulin alfa-1B lánc 0,40 0,20 nyálfehérje mikrotubulus
komponens nyál* [335]
O75083 WD ismétlés tartalmú
fehérje 1 0,13 0,02 nyálfehérje sejt migráció NA
Minden fehérje esetében feltüntettük az UniProt azonosítót, a fehérje nevét, besorolását aszerint, hogy nyálfehérje vagy akut fázis fehérje és a funkcióját. A besoroláshoz a Sys-Body
Fluid adatbázist és irodalmi adatokat használtunk [312,332,344–348], a funkciót a Gene Ontology alapján állapítottuk meg. Ugyanakkor az azonosításhoz használt egyedi peptidek száma, az OSCC/CTL arány és a megfelelő p érték is feltüntetésre került. A korábban
OSCC-ben azonosított fehérjék esetéOSCC-ben a minta típusát is feltüntettük. A * arra utal, hogy nem az általunk azonosított fehérjét, hanem egy másik, de ugyanabba a családba tartozó változatát azonosították más kutatások a betegséggel összefüggésben, míg az „NA” azt jelenti, hogy
korábban nem azonosították a fehérjét a betegségben. A dőlt betűvel szedett fehérjék esetében statisztikailag szignifikáns volt a változás a két csoport között.
Az általunk azonosított fehérjék jelentős részét már korábban vizsgálták OSCC-ben és 32 fehérjét kimutattak OSCC-ben szenvedő betegektől származó nyálmintákban (12.
táblázat). Egy célzott proteomikai módszereket alkalmazó kutatás már korábban összefüggésbe hozta a komplement C4B (C4B), a komplement faktor B, komplement C3 és alfa-1 antitripszint az OSCC-vel: úgy találták, hogy a fehérjék magasabb szintje az OSCC megjelenésének magasabb kockázatával jár együtt [336]. Shotgun proteomikai analízisek eredményeként egy másik kutatócsoport az apolipoprotein A és E, a paraoxonáz (PON) 1, inter-alfa tripszin inhibitor H1, H2, H4 láncok, kininogén 1, AMBP protein, nukleobindin 2, SERPIND1 és SERPINA6 mennyiségét emelkedettnek találta OSCC-ben szenvedő betegek nyálában [335]. Megfigyelték azt is, hogy az ApoE jelenléte az OSCC invazívabb formáival jár együtt [349]. Ugyanakkor, az alfa-1 savas glikoproteint, alfa-1B glikoproteint, alfa amilázt, béta-2 glikoproteint, szénsav anhidráz 1-t, cisztatin SA-t, hemopexint, foszfoglicerát kinázt és szérum albumint ígéretes OSCC markerként azonosították [329,330,333].
Tanulmányunkban az OSCC-re jellemző fehérjének talált fibrinogén alfa, béta és gamma láncot, haptoglobint, SERPINB5-t, retinol kötő fehérje 4-t és a cöruloplazmint korábban szérum OSCC markerként azonosították, míg az integrin alfa-M-t és a fibronektin FN1-t kimutatták a tumor szövetben [337,339–343].
36 általunk OSCC-re jellemző fehérjeként azonosított fehérjét nem vizsgáltak, vagy vizsgáltak, de esetükben nem találtak összefüggést a fehérje mennyisége/jelenléte és a betegség között. A plazminogént és angiotenzinogént nem azonosították OSCC-ben, viszont azt megfigyelték, hogy a plazminogén aktivátor rendszer a korai OSCC prediktív markere lehet, illetve az angiotenzinogén konvertáló enzim a malignus epiteliális neopláziákra jellemző [350,351]. Hat fehérje esetében nem az általunk azonosított forma, hanem a fehérje egy másik izoformája, vagy ugyanabba a családba tartozó rokon fehérje jelenlétét találták OSCC-re jellemzőnek. A SERPINB5 esetében ellentmondásos adatok állnak rendelkezésre, ugyanis mi azt találtuk, hogy mennyisége megnő OSCC-ben, viszont más kutatások szerint a SERPINB5 és más SERPINB formák mRNS szintje alacsonyabb az OSCC-ben, illetve a magasabb SERPINB5 szint jobb prognózissal társul [352,353]. A plazma proteáz C1 inhibitor (SERPING1), antitrombin III és fibronektin jelenlétét kimutatták ugyan daganatokban, de szájüregi daganatokkal eddig nem hozták összefüggésbe [354,355]. Az apoB100 és komplement faktor H (CFH) jelenlétét sem igazolták eddig szájüregi laphámrákban, viszont a CFH-t tüdő adenokarcinómában, illetve bőr laphám daganatokban, az apoB100-t pedig fejnyaki laphámrákban szenvedő betegek szérumában megtalálták [356–
358]. A komplement C5 és mucin 7 daganatokban való jelenlétéről nincs információnk, de a
komplement rendszer komponensei és más mucin formák gyakran kimutathatók különböző daganatokban, köztük az OSCC-ben is [336,359].
Következő lépésként a megállapított mennyiségek alapján egy hierarchikus klaszterezést végeztünk és az eredményeket hőtérkép formájában jelenítettük meg (32. ábra).
32. ábra. A nyálmintákban a két csoport között legalább kétszeres különbséggel kimutatott fehérjék mennyiségi analízise.
A kontroll (CTL) és OSCC mintákban azonosított fehérjék relatív peptid számai alapján végzett klaszter analízis és a felrajzolt hőtérkép. A fehérjéket a génnevek alapján jelöltük.
Az eredmények azt mutatták, hogy az OSCC és a kontroll csoportok elkülöníthetők egymástól, bizonyos fehérjék csak az egyik, vagy csak a másik állapotra jellemzők. Nyolc olyan fehérjét találtunk, amelyek csak az egyik csoportban jelennek meg. Az ApoE, a komplement C5, komplement faktor H, SERPINA6, SERPIND1 és paraoxonáz 1 a kontroll mintákban nem volt kimutatható, csak az OSCC-ben szenvedő betegek mintáiban. Ezzel szemben a citokróm c és a mucin 7 csak a kontroll mintákban volt detektálható.
A citokróm c-ről kimutatták, hogy felszabadulása gátolt OSCC-ben; a HIF-1alfa-függő apoptózis gátlás az OSCC-ben a citokróm c felszabadulásának gátlásával valósul meg [338].
Eredményeink alapján az OSCC csoportban növekedést vagy csökkenést mutató fehérjék interakciós hálózatait a String segítségével rajzoltuk meg és elvégeztük funkcionális analízisüket.
Az OSCC-ben csökkenést mutató fehérjék egy kevés interakciót mutató hálózatba rendeződnek, funkcionális szempontból diverzek (33. ábra).
33. ábra. Az OSCC-ben kisebb mennyiségben előforduló fehérjék hálózata.
A hálózatot a String segítségével rajzoltuk meg. A golyók a fehérjéket, a vonalak pedig a fehérjék közötti interakciókat jelentik. A fehérjéket a génnevek alapján jelöltük.
A String analízis nem mutatott ki feldúsult GO funkciót. Feldúsulás csak a lokalizációban mutatkozott (13. táblázat).
13. táblázat. Az OSCC-ben kisebb mennyiségben előforduló fehérjék esetében a feldúsult GO funkciók
GO funkció azonosító GO funkció megnevezés Megfigyelt
fehérjék száma FDR I. Lokalizáció
GO.0070062 Extracelluláris régió rész 24 3.56e-09
GO.0005576 Extracelluláris régió 26 1.69e-09
GO.0031988 Extracelluláris exoszóma 25 1.11e-12
GO.0044421 Membrán-kötött vezikula 25 1.09e-10
A táblázatban a GO funkciók azonosítója mellett feltüntettük a GO funkciók megnevezését, valamint az adott funkcióhoz tartozó fehérjék számát a hálózatban. Ezen
kívül feltüntetésre kerültek az FDR értékek is.
A fehérjék döntően extracelluláris térben lokalizálódnak, ami a fehérje azonosításunk minőség ellenőrzésére is szolgálhat, utalva annak helyességére, mivel nyálfehérjéket vizsgálva ez a várt eredmény.
Ezzel szemben az OSCC-ben növekedést mutató fehérjék egy nagyon kapcsolt, sok interakcióval rendelkező hálózatba rendezhetők (34. ábra).
Bizonyos fehérjék, mint az inter alfa-tripszin inhibitor H1 és H2 láncok (ITIH1, ITIH2), paraoxonáz 1, ApoA4, retinol kötő fehérje 4 (RBP4), hemoglobin alfa és béta láncok (HBA1, HBB), SERPINA6, antikimotripszin (AACT), AMBP a periférián helyezkednek el, de számos kapcsolatot alakítanak ki a hálózat központibb elhelyezkedésű fehérjéivel. Ezzel szemben más fehérjék, mint a SERPINB5, szénsav anhidráz 1 (CA1) és SERPINF1 a periférián helyezkednek el, és kevés interakciót alakítanak ki a hálózatban szereplő többi fehérjével. Ugyanakkor megfigyelhető a komplement faktorok klasztere, amely számos interakcióval kapcsolódik a hálózat központi elhelyezkedésű, sok kapcsolattal rendelkező elemeihez.
34. ábra. Az OSCC-ben nagyobb mennyiségben előforduló fehérjék hálózata.
A hálózatot a String segítségével rajzoltuk meg. A golyók a fehérjéket, a vonalak pedig a fehérjék közötti interakciókat jelentik. A fehérjéket a génnevek alapján jelöltük.
A funkcionális elemzés szerint az immunreguláció és a lipid transzporthoz kapcsolódó funkciók dúsultak fel (14. táblázat).
14. táblázat. Az OSCC-ben nagyobb mennyiségben előforduló fehérjék esetében a feldúsult GO funkciók
GO funkció
azonosító GO funkció megnevezés Megfigyelt fehérjék
száma FDR
I. Biológiai folyamat