Biomarkerek azonosítása

A proteomikai technikák által biztosított érzékenység és áteresztőképesség az orvostudományban a biomarkerek kutatása és terápiás célpontok azonosítása terén nyit lehetőségeket. A biomarkerek olyan fehérjék, amelyek segítségével betegségek diagnosztizálhatók, a betegség megjelenése vagy a komplikációk kialakulása előrejelezhető, vagy a terápia hatásossága nyomon követhető [107]. Több stratégia alkalmazható a biomarkerek azonosítására, az egyik leggyakrabban alkalmazott a National Cancer Institute által ajánlott stratégia [108]. Az esetek legnagyobb részében a biomarkerek azonosítása a felfedezéssel kezdődik. Ebben a fázisban a megfelelően megválasztott beteg és a kontroll csoportok közötti különbségeket vizsgáljuk shotgun tömegspektrometriás technikák segítségével. Általában csoportonként 3-5 donortól származó mintában az összes lehetséges fehérjét azonosítjuk, majd a két csoport közötti statisztikailag szignifikáns különbséget mutató fehérjéket kiválogatjuk. Ezek száma egy kellően érzékeny analitikai rendszer esetében több tíz, akár száz is lehet. A kiválasztott fehérjéket ezután nagyobb mintaszámon ellenőrzik, általában valamilyen célzott tömegspektrometriás módszer segítségével. Ebben a fázisban a cél az, hogy tovább szűkítsük a potenciális markerek számát. Az ellenőrzés után következik a validálás, amikor a kiválasztott néhány fehérje mennyiségét több ezer donor esetében megvizsgálják. Amennyiben a fehérje segítségével nagy mintaszámon is megfelelő szenzitivitással és specificitással különbséget lehet tenni a beteg és a kontroll minták között, a fehérjét alkalmazni lehet a klinikai diagnosztika során [109,110].

A szakirodalomban számos potenciális biomarkert közöltek a különböző betegségek esetében, de a Food and Drug Administration (FDA) által elfogadott biomarkerek száma

viszonylag alacsony, ugyanis különböző okok miatt a potenciális biomarkerek közül csak keveset sikerül validálni nagy mintaszámon [111–114].

A biomarkerek kutatása legrelevánsabb a probléma helyéhez legközelebbi szövet vagy szerv esetében lehet, mivel itt a legnagyobb a valószínűsége annak, hogy olyan fehérjéket sikerül azonosítani, amelyek eltérése összefüggésben van a betegséggel [115].

Ugyanakkor azt is figyelembe kell venni, hogy ilyen minták gyűjtése sokszor invazív módszerrel, esetleg műtéti beavatkozással lehetséges pl. biopsziák, retina, csarnokvíz, agy-gerincvelői folyadék stb. Emiatt az ilyen jellegű minták szűrésre nem alkalmazhatók. A legkézenfekvőbb lenne diagnosztikai szempontból olyan biológiai minták használata, amelyek nem invazív vagy minimálisan invazív módon gyűjthetők. A szérum és vizelet vizsgálata már régóta a laboratóriumi diagnosztika alapját képezik, viszont egyre jobban előtérbe kerül a nem invazív módon gyűjthető nyál, könny és verejték vizsgálata [116].

2.3.3.1. A kémiai barrier, mint potenciális biomarker forrás

Szervezetünk folyamatos támadásoknak van kitéve a környezetben levő mikroorganizmusok részéről, ugyanis szervezetünk anyagai jó táplálékforrást szolgáltatnak számukra. A bőrünk és a nyálkahártyáink ezért megfelelő védelmet kell biztosítsanak; fizikai barrierként elválasztó felületet képeznek szervezetünk és környezetünk között, elhatárolva szervezetünket a környezet anyagaitól és biztosítva integritásunkat [117]. Ugyanakkor a szervezet-környezet határfelületen intenzív folyamatok zajlanak [118]. A fizikai barrier mellett a termelt folyadékokkal testünk aktívan védekezik a potenciális patogének ellen. A könny, a verejték, a nyál, vagy az orrváladék például, hígítja a potenciális behatolókat, partikuláris részecskéket és mintegy kimosva megpróbálja eltávolítani a lehetséges behatolási pontokról. A megnövekedett folyadékmennyiséggel és áramlással csökkenthető a potenciális patogének száma. Emellett olyan anyagokat is tartalmaznak, amelyek ellehetetlenítik a patogének megtelepedését, különböző mechanizmusokkal pusztítva azokat [119–121]. Így, a potenciális behatolási felszíneken, vagyis minden olyan ponton, ahol szervezetünk a külvilággal érintkezik, a fizikai határ mellett van egy jól felépített ún. kémiai barrier is, amely fehérjék és kismolekulák segítségével elpusztítja a mikroorganizmusokat. A kémiai barrier fő komponensei az ún. antimikrobiális és immunmodulátor fehérjék (AMP) családjába tartozó kisebb és nagyobb peptidek és fehérjék [117,118,122].

A kémiai barrier komponensei mellett a szervezetünkben élő baktériumok is segítenek a potenciális patogénekkel szembeni védelemben. Az evolúció során egy mindkét fél számára kölcsönös előnyöket biztosító kapcsolat alakult ki, és az emberi szervezet ezekkel a

mikroorganizmusokkal mintegy szövetségben képes megbirkózni a különböző feladatokkal [123]. Testünk táplálékforrást szolgáltat a velünk együtt élő, ún. kommenzális baktériumok számára, azok viszont antimikrobiális peptidjeik révén és a táplálékok felhasználásával gátolják a potenciális patogének megtelepedését. Szervezetünk egy AMP koktélt termel folyamatosan, amely segítségével szabályozni tudja a határfelületeken élő mikroorganizmusokat [123]. Az AMP koktél a szervezetünk és a mikroorganizmusok által termelt AMP peptidek és fehérjék keveréke, amelynek összetétele folyamatosan változik, így védve ki a potenciális patogén mikrobák támadásait és tolerálva a kommenzális baktériumokat.

Környezetünk, életmódunk (pl. sportolás, kozmetikumok használata stb.) és a testünkben végbemenő fiziológiás vagy patológiás változások módosítják az AMP koktél összetételét, és ezáltal a kommenzális baktériumok számát, típusát [123]. Amikor a jól beállított egyensúly felbomlik, akkor betegségek lépnek fel. Atópiás dermatitiszben például megfigyelték a bőr fő AMP-jének a dermcidin szintjének a csökkenését, vagy irritábilis bél szindrómában és ulceratív kolitiszben a humán béta defenzinek szintjének változását [124,125].

Az antimikrobiális és immunmodulátor fehérjék családjába tartozó peptidek és fehérjék a kémiai barrier fontos komponensei [122,126]. Jelenleg a különböző adatbázisokban több, mint 180 olyan fehérjét gyűjtöttek össze, amelyek AMP tulajdonságokkal rendelkeznek [127–130]. Ezek lehetnek nagyobb molekulák, mint például a lizozim vagy laktoferrin, de tipikusan 15-50 aminosavas peptidek, vagy kisebb fehérjék.

Szerkezetük stabil, alkalmazkodva a különböző helyeken levő körülményekhez, pl. magas só koncentráció, pH, proteázok jelenléte stb. Az AMP-ket többféle módon lehet csoportosítani.

Termelődésük szerint lehetnek állandóan jelen lévő, konstitutívan termelődők, mint pl. a dermcidin, pszoriazin, RNáz 7, vagy lehetnek indukálhatók, mint bizonyos defenzinek, katelicidin peptidek stb., amelyek csak meghatározott stimulusok hatására termelődnek [126,131,132]. Az AMP-k termelődését gyulladásos citokinek (pl. IL-1β) vagy maguk a baktériumok indukálhatják [133]. Funkcióik szerint lehetnek antibakteriálisak, antivirálisak, illetve rendelkezhetnek immunmodulátor funkciókkal [134].

A defenzinek fő funkciója az antimikrobiális védekezés és az immunsejtek modulációja [126]. Az alfa és béta defenzinek jelentős szekvenciális és térszerkezeti homológiát mutató fehérjék, amelyek a prekurzor aminosav sorrendjében, az aktív peptidek hosszában és a szekréció helyében különböznek egymástól [126,135–137]. A béta defenzinek szerkezete nagy stabilitást mutat, egy speciális béta redős szerkezetet vesznek fel, amelyet

béta defenzin struktúrának neveznek [138]. Több béta defenzin szekvenciát tárolnak az UniProt adatbázisban, de nagyobb mennyiségű információ a humán béta defenzin (hBD) 1, 2, 3, és 4-ről áll rendelkezésre. A hBD 1 és 4 a konstitutívan experesszálódó, míg a hBD 2 és 3 az indukálható béta defenzinek közé tartozik [139,140]. A béta defenzineket főként az endotél sejtek termelik, és védelmet nyújtanak bizonyos Gramm negatív baktériumokkal és Candida törzsekkel szemben [141]. Ugyanakkor fontos kemotaktikus anyagok, amelyek szerepet játszanak az immunsejtek fertőzés helyére való irányításában és vonzásában [142].

Emelkedett hBD2 szintet mértek gyulladt béltraktusú betegek székletében, és magas hBD3 szint jellemezte az ulceratív kolitiszes betegek vastagbelének nyálkahártyáját [143,144]. A hBD4 esetében kimutatták, hogy kapcsolatot alakít ki a lizozim C-vel, és a hBD3-al közösen, egymás hatását kölcsönösen erősítve működnek [133].

A defenzinek kívül más AMPk is, mint például a dermcidin, lizozim C, prolaktin indukált fehérje, laktoferrin, katelicidin stb. megtalálhatók a kémiai barrierek összetételében.

A dermcidin és az egymással átfedő szekvenciájú dermcidin peptidek mind az antimikrobiális védelemben, mind az immunmodulációban részt vesznek, széles antimikrobiális aktivitással rendelkeznek és ellenállóak az alacsony pH-nak és a magas sókoncentrációnak [126,145]. A katelicidin a dermcidinhez hasonlóan kis, bázikus peptidek összessége, amely inaktív prekurzor formájában termelődik, és a neutrofilekben a szerin proteináz 3, míg a bőrben a kallikrein 5 és 7 hatására aktiválódik. Az LL-37 katelicidin peptid széles antimikrobiális spektrummal rendelkezik, de emellett részt vesz az angiogenezisben, kemotaxisban, citokin termelésben és a sebgyógyulásban [146–151]. A lizozim C, laktoferrin, prolaktin indukált fehérjék, kluszterinek nagyobb fehérjék, amelyeknek változatos szerepük van: a lizozim C elsősorban a peptidoglikán sejtfal bontásáért felelős, valamint immunmodulátor aktivitással rendelkezik; a laktoferrin megköti a baktériumok számára fontos vasat, valamint antimikrobiális, gyulladásellenes és daganat ellenes hatású; míg a kluszterinek chaperonként működnek és mátrix metalloproteináz (MMP) gátlók [152–155]. A prolaktin indukált fehérje általában az apokrin mirigyekben termelődő szekretált fehérje, amelynek megnövekedett mennyiségét kimutatták daganatokban pl. emlődaganatban [156]. A pontos funkciója nem ismert, szerepe van az immunmodulációban és a T sejtek apoptózisának gátlásában [157].

A különböző betegségek hatására megváltozó kémiai barrier összetétel diagnosztikus jelentőségű lehet. Kutatómunkám során behatóan tanulmányoztam a könny, nyál és verejték összetételét és annak változásait különböző betegségekben. Vizsgáltam a könnyet Alzheimer kór és zöldhályog esetén, a nyál fehérje összetételének változásait szájüregi laphámrákban, valamint a normális, hő hatására termelődő verejték összetételét.