Humán béta defenzinek vizsgálatára alkalmas MRM/SRM-alapú célzott tömegspektrometriás módszer kifejlesztése

A defenzinek a veleszületett immunitás fontos elemei és nagy mennyiségben találhatók meg a különböző testfolyadékokban [126,134]. Annak érdekében, hogy a

defenzinek könnyebben vizsgálhatók legyenek, egy célzott tömegspektrometriás módszer fejlesztésébe kezdtünk, amely segítségével a humán alfa és béta defenzinek mennyisége vizsgálható. Célunk az volt, hogy a kifejlesztett módszert IL-1β kezeléssel stimulált, illetve nem kezelt kontroll HT-29, SW-116, Caco2 bél epitél sejteken és sejtkultúra felülúszókon teszteljük (14. ábra).

14. ábra. A kutatás során alkalmazott munkafolyamat.

Módszertervezésünk első lépéseként megpróbáltunk olyan triptikus peptid szekvenciákat azonosítani, amelyek egyediek az adott defenzinre. Sajnos a humán alfa defenzinek esetében nem sikerült ilyen szekvenciát azonosítani, ezért a módszerfejlesztés további részében csak a béta defenzinekre koncentráltunk. Az MRM/SRM-alapú módszer kifejlesztésével és a paraméterek optimalizálásával sikerült egy jól működő, szemikvantitatív célzott proteomikai módszert kifejleszteni, amelynek segítségével lehetővé válik a humán béta defenzin (hBD) 1, 2, 3 és 4 mennyiségének egyidejű analízise. Az MRM/SRM-alapú tömegspektrometriás analízis során az IQGTCYT hBD1 peptidet, a GIGDPVTCLK hBD2 peptidet, a GIINTLQK hBD3 peptidet és az ICGYGTAR hBD4 peptidet vizsgáltuk.

A nem indukálható hBD1 és hBD4 [139,140] esetében a várt hatást tapasztaltuk (15. ábra).

15. ábra. A humán béta defenzin 1 és 4 mennyiségének vizsgálata bélhámsejt kultúrák lizátumában és sejtkultúra felülúszókban.

Az oszlopdiagramok három kísérlet során nyert értékek átlagát jelenítik meg. Az „y”

tengelyen az endogén:stabil izotóppal jelezett (SIL) peptid arányt, míg az „x” tengelyen a sejttípusokat tüntettük fel. Szürke színnel a kontroll, míg feketével az indukált sejtekből származó mintákból nyert értékeket jelöltük. A * a statisztikailag szignifikáns (p < 0,05)

különbségeket mutatja.

A hBD1 és hBD4 mennyisége az IL-1β kezelés hatására nem növekedett, sőt a hBD1 szintje a Caco2 sejtekben, és a szekretált hBD4 mennyisége a HT-29 sejtek esetében statisztikailag szignifikánsan csökkent a kezelés hatására Az indukálható béta defenzinek esetében a várt eredményt kaptuk; az intracelluláris és szekretált hBD2, és hBD3 szintje megnőtt az IL-1β kezelés hatására (16., 17. ábra).

16. ábra. A humán béta defenzin 3 mennyiségének vizsgálata bélhámsejt kultúrák lizátumában és sejtkultúra felülúszókban.

Az oszlopdiagramok három kísérlet során nyert értékek átlagát jelenítik meg. Az „y”

tengelyen az endogén:SIL peptid arányt, míg az „x” tengelyen a sejttípusokat tüntettük fel.

Szürke színnel a kontroll, míg feketével az indukált sejtekből származó mintákból nyert értékeket jelöltük. A * a statisztikailag szignifikáns (p < 0,05) különbségeket mutatja.

A kifejlesztett tömegspektrometriás módszert kollaborációs partnerünk hBD2-re specifikus RT-qPCR és ELISA analízisekkel ellenőrizte, és a különböző vizsgálatokban nagyságrendileg hasonló értékeket kaptunk (17. ábra).

A tömegspektrometriás módszerrel, valamint az ELISA-val kapott érték korrelációs analízisét elvégezve azt tapasztaltuk, hogy az ELISA és a kifejlesztett tömegspektrometriás módszerrel mért hBD2 szintek jó egyezést mutattak (R=0,9636, p<0,0001).

Az optimalizált módszer a klasszikus antitest alapú vizsgálatok egy reális alternatívájaként szolgálhat, elsősorban olyan esetekben, amikor a minta mennyisége nem teszi lehetővé az egymást követő ELISA analízisek elvégzését.

A szakirodalomban fellelhető adatoknak megfelelően, sikerült igazolni a hBD2 és hBD3 indukálható jellegét [139,140], ugyanis a vizsgált kísérleti rendszerekben az IL-1β gyulladásos citokin hatására megnőtt mind a szekretált, mind a sejten belüli mennyiségük.

17. ábra. A humán béta defenzin 2 mennyiségének vizsgálata Caco2 bélhámsejt kultúrák lizátumában és sejtkultúra felülúszókban a kifejlesztett MRM/SRM illetve

ELISA módszer segítségével.

Az oszlopdiagramok három kísérlet során nyert értékek átlagát jelenítik meg. Az „y”

tengelyen az MRM/SRM módszerrel mért endogén:SIL peptid arányt, illetve az ELISA-val mért koncentráció (pg/ml) értékeket, míg az „x” tengelyen a minta típusát tüntettük fel.

Szürke színnel a kontroll, míg feketével az indukált sejtekből származó mintákból nyert értékeket jelöltük. A * a statisztikailag szignifikáns (p < 0,05) különbségeket mutatja.

A következő lépésben a kifejlesztett MRM/SRM-alapú kvantitálási módszert humán mintákon alkalmaztuk. Tekintve, hogy az általam vezetett kutatócsoport egyik fő érdeklődési területe a könny kémiai barrierjének vizsgálata, a kifejlesztett módszerrel megvizsgáltuk a humán béta defenzinek mennyiségét könnyben. A módszerünk megfelelőségének ellenőrzésére két könny poolt alkalmaztunk, egészséges felnőttektől és Alzheimer kórban szenvedőktől származó könnymintákat vizsgáltunk meg.

Az Alzheimer kóros betegektől származó agyszövetben kimutatták a humán béta defenzin 1, 2 és 3 emelkedett szintjét, valamint szérum és agy-gerincvelői folyadékban igazolták a humán béta defenzin 2 emelkedett mennyiségét [205,206], viszont az általunk kifejlesztett módszer segítségével nem sikerült a humán béta defenzineket kimutatni Alzheimer kóros betegektől származó könnymintákban. Ezzel szemben az egészséges

felnőttektől származó könnymintákban mind a négy vizsgált defenzint ki tudtuk mutatni, igazolva a módszerünk használhatóságát humán könnyminták vizsgálatára. Az egymáshoz viszonyított relatív mennyiségüket megvizsgálva azt tapasztaltuk, hogy a hBD3 mennyisége a legmagasabb, a hBD2 mennyisége a legalacsonyabb, míg a hBD1 és hBD4 mennyisége majdnem azonos volt az egészséges felnőttektől származó könnyben (18. ábra).

18. ábra. A humán béta defenzinek mennyiségének vizsgálata könnyben.

Az oszlopdiagram három kísérlet során nyert értékek átlagát jeleníti meg. Az „y” tengelyen az endogén:SIL peptid arányt, míg az „x” tengelyen a vizsgált béta defenzineket tüntettük fel.

A könnyben található hBD2 mennyiségét ELISA segítségével is meghatároztuk, és a sejtkultúrás vizsgálatokhoz hasonlóan, a könnyben is jó egyezést mutat a két módszerrel mért hBD2 mennyisége (19. ábra).

19. ábra. Könnymintákban mért hBD2 mennyisége MRM/SRM és ELISA módszer segítségével.

Az MRM/SRM és ELSIA analízissel nyert értékeket oszlopdiagramon ábrázoltuk. Az „x”

tengelyen a mintákat, a bal oldali „y” tengelyen az endogén:SIL peptid arányt, míg a jobb oldali „y” tengelyen az ELISA-val mért fehérje koncentrációt ábrázoltuk. Szürkével az MRM/SRM, míg feketével az ELISA módszer alkalmazásával kapott értékeket tüntettük fel.

A korreláció analízis eredményét bemutató ábrán az „x” tengelyen az ELISA-val, míg az „y”

tengelyen a kifejlesztett MRM/SRM módszer segítségével kapott AUC értékeket ábrázoltuk.

Az ábra e részén az értékek ábrázolásához log skálát használtunk.

Eredményeink alapján a kifejlesztett tömegspektrometriás módszer megfelelően működik sejtkultúrás vizsgálatokban, és használhatónak bizonyult hBD1, hBD2, hBD3 és hBD4 egyidejű mennyiségi analízisére humán könnymintákban.