Fehérje-fehérje interakciós hálózatok analízise

Annak érdekében, hogy az adatsorban levő többi információt is fel tudjuk használni, a String adatbázis segítségével, szigorú kritériumok alkalmazásával, felrajzoltuk az egyes csoportokban azonosított fehérjék interakciós hálózatát (46. ábra).

A rajzoláshoz a kontroll és a HIV-1 kezelt sejtek esetében a 0 óra időpontban begyűjtött mintákból származó információkat kombináltuk és az ebből felrajzolt hálózatot neveztük el kiindulási hálózatnak (NW). A C04 ill. C12 hálózatok a kontroll, míg a H04 és H12 hálózatok a transzdukált sejtek különböző időpontokban begyűjtött mintáinak elemzéséből származó fehérjék hálózatai.

A hálózatok elemzéséből jól látható, hogy a kezdeti állapothoz képest az idő elteltével csökken a fehérjék, és a fehérje-fehérje interakciók száma.

Mivel a String vagy Cytoskape által felrajzolt bináris hálózat csak azt mondja meg, hogy az adatbázisban felhalmozott információk szerint lehet-e kapcsolat a két fehérje között (46. ábra), az adatok alapján létrehozott hálózatban figyelembe kell venni az adatsorban levő mennyiségi információkat is. Az Arizonai Egyetem Proteomika Laboratóriumában végzett analízisek mennyiségi adatot is szolgáltattak; az egyes fehérjék MS/MS alapú analízise során a felvett MS/MS spektrumok száma, megfelelő normalizálás után, megadta a fehérjék relatív mennyiségét a mintákban. A mennyiségi adatokat egy egyszerű statisztikai modell segítségével beillesztettük a hálózatba.

Ebben a formában a hálózat már nem csak az elméleti kapcsolódási lehetőséget mutatta, hanem a kapcsolatokat átalakítottuk az adott fehérje pár becsült kapcsolati intenzitásává, amely egyenesen arányos a kapcsolatba lépő fehérjék mennyiségével és fordítottan arányos a kapcsolatok számával (47. ábra).

Tekintve, hogy százas nagyságrendű fehérje és fehérje-fehérje interakció elemzését kellett elvégezni, a hálózatokat tovább bontottuk alhálózatokra a fehérjék funkciói szerint. A String adatbázis képes kilistázni a feldúsult GO funkciókat. Ezt felhasználva a String által kilistázott összes olyan statisztikailag szignifikáns módon feldúsuló GO funkciót figyelembe vettük, ahol a fehérjék száma meghaladta a 10-t.

46. ábra. Az egyes mintákban tömegspektrométerrel azonosított fehérjék hálózata.

A gömbök a fehérjéket, míg a vonalak a fehérjék közötti interakciókat jelzik. A zöld szín az RNS splicing, a kék szín a transzláció, míg a piros szín a transzport GO funkciókra utal.

Mindegyik hálózat esetében feltüntettük a fehérjék számát (N) és az interakciók számát (E).

Az így kapott, legalább 10 tagot számláló hálózatot funkcionális alhálózatnak (f) neveztük el, és a String által listázott GO funkció kódjával jelöltük. A fehérje hálózat többi tagját az adott GO funkcióra nézve a nem funkcionális alhálózat (n) tartalmazta.

Mivel előfordult olyan eset is, hogy egy funkcionális hálózatban levő fehérje nem funkcionális hálózatban levő fehérjével alakított ki kapcsolatot, bevezettük a funkcionális-nem funkcionális hálózatok közötti, ún. kereszt (cross) kapcsolatok vizsgálatát is (47., 48.

ábra).

47. ábra. Hálózat típusok.

A String által generált fehérje-fehérje interakciós adatokat felhasználva circlize szoftver segítségével rajzoltuk meg a reprezentatív hálózatokat. A körök a fehérjék jelölésére használt génneveket ABC sorrendben tartalmazzák. A vonalak az egyes fehérjék közötti interakciókat jelzik. A vonalak vastagsága a súlyozott hálózatokban az interakcióra utal; minél vastagabb a vonal, annál nagyobb az interakció valószínűsége. A súlyozott alhálózat esetén a színeknek jelentőségük van: a vörös színnel jelölt fehérjék a véletlenszerűen kiválasztott GO funkcióhoz

(GO:0044765) tartoznak, ezáltal a funkcionális alhálózat részei. A funkcionális alhálózatban résztvevő fehérjék közötti interakciókat piros színnel, a funkcionális hálózatban részt nem vevő fehérjék közötti interakciókat szürke színnel, míg a funkcionális, ill. nem funkcionális

hálózat elemei közötti interakciókat zöld színnel jelöltük.

48. ábra. Hálózati változások megjelenítése a GO:0044765 funkcionális alhálózat esetében.

A piros színnel jelölt fehérjék a véletlenszerűen kiválasztott GO funkcióhoz (GO:0044765) tartoznak, ezáltal a funkcionális alhálózat részei. A funkcionális alhálózatban résztvevő

fehérjék közötti interakciókat piros színnel, a funkcionális hálózatban részt nem vevő fehérjék közötti interakciókat szürke színnel, míg a funkcionális, ill. nem funkcionális hálózat

elemei közötti interakciókat zöld színnel jelöltük. A vonalak vastagsága az interakcióra utal;

minél vastagabb a vonal, annál nagyobb az interakció valószínűsége. Az NW hálózat a kezdeti (0 óra) időpontra utal, a C04 és C12 a kontroll 4 órás, ill. 12 órás, míg a H04 és H12 a

HIV-1 kezelt 4 órás, ill. 12 órás időpontokban megfigyelt fehérje-fehérje interakciós hálózatra vonatkozik.

A továbbiakban már a súlyozott hálózatokkal dolgoztunk és megvizsgáltuk a fehérjéket jelentő csomópontok számát (N), az interakciókat szimbolizáló élek számát (E), a hálózati erősséget (S) és az élsűrűséget (D) (49. ábra).

49. ábra. Hálózati paraméterek.

Az ábrákon az „x” tengelyen a mintavételi időpontokat tüntettük fel, míg az „y” tengely az egyes paraméterek esetében számított értékeket tartalmazza. Az „N” a csomópontok számára,

míg az „E” az interakciók számára utal. Az „S” a hálózati erősséget és „D” az élsűrűséget jelöli. Kék színnel a kontroll, míg piros színnel a HIV-1 kezelt állapotot jelöltük.

A hálózatok esetében kiszámolt hálózati paramétereket felhasználva statisztikai elemzést végeztünk. A fő hálózatot vizsgálva azt tapasztaltuk, hogy a H12-ben a fehérjék száma (N) statisztikailag szignifikáns módon csökkent, utalva a bináris hálózat esetében is megfigyelhető zsugorodásra (vö. 46., 49. ábra). Ennek ellenére az interakciók száma (E) és a hálózati erősség (S) nem változott statisztikailag szignifikáns módon, míg az élsűrűség (D) statisztikailag szignifikáns módon megemelkedett. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a HIV-1 transzdukciót követően 12 óra elteltével kevesebb, de egymással több kapcsolatot kialakító fehérje látja el a feladatát. Ezzel szemben a 4 órás időpontban egy kissé másabb képet

láttunk: a fehérjék és a kapcsolatok száma, valamint a hálózati erősség nem változott statisztikailag szignifikáns mértékben, viszont az élsűrűség statisztikailag szignifikáns mértékben csökkent a HIV-1 transzdukciót követően.

Ezeket a számolásokat elvégeztük minden funkcionális, nem funkcionális és kereszt alhálózat esetében, így megkaptuk az adott funkcionális hálózatra jellemző Nf, Ef, Sf és Df értékeket, valamint a nem funkcionális hálózatra jellemző Nn, En, Sn és Dn értékeket. A funkcionális-nem funkcionális hálózatok közötti keresztkapcsolatok esetében az élek számát és az ebből származtatott paramétereket számoltuk ki, így megkaptuk az Ec, Sc és Dc paramétereket. Ezen kívül a funkcionális-nem funkcionál hálózatok közötti kapcsolatokra bevezettük a funkcionális-nem funkcionális él arányt (R) (50. ábra).

50. ábra. A GO:0008380 (RNS splicing) funkcióra jellemző hálózati paraméterek.

Az ábrákon az „x” tengelyen a mintavételi időpontokat tüntettük fel, míg az „y” tengely az egyes paraméterek esetében számított értékeket tartalmazza. Az „N” a csomópontok számára,

míg az „E” az interakciók számára utal. Az „S” a hálózati erősséget és „D” az élsűrűséget, míg az „R” a funkcionális-nem funkcionális élarányt jelöli. Az „f” a funkcionális alhálózatra,

az „n” a nem funkcionális hálózatra, míg a „c” a funkcionális és nem funkcionális alhálózat elemei közötti kersztkapcsolatokra utal. Kék színnel a kontroll, míg piros színnel a HIV-1

kezelt állapotot jelöltük.

Annak érdekében, hogy megállapítsuk, hogy mely funkcionális hálózatokhoz köthetők a főhálózaton megfigyelt változások, a funkcionális alhálózatok tanulmányozásába kezdtünk.

A H4 és H12 hálózatokban kilistáztuk azokat a GO funkciókat, ahol az egyes hálózati paraméterek statisztikailag szignifikáns mértékű változást mutattak. Az volt az elképzelésünk, hogy azon funkcionális alhálózatok segítségével lehetünk képesek megmagyarázni a főhálózaton megfigyelt jelenséget, amelyek esetében statisztikailag szignifikáns változás van a funkcionális hálózati paraméterekben, és nincs statisztikailag szignifikáns mértékű változás a nem funkcionális hálózati paraméterekben.

Csak öt olyan alhálózatot találtunk, ahol a fehérjék száma (Nf) csökkent a funkcionális hálózatokban: GO.0005759, GO.0016604, GO.0044451, GO.0044712 és GO.0071705. Az Ef és Sf értékekben viszont sehol sem tapasztaltunk statisztikailag szignifikáns változást. A D és R értékeket figyelembe véve már több lehetőség kínálkozott.

Azokat a funkcionális alhálózatokat listáztuk ki, ahol i) a statisztikailag szignifikáns változás csak a funkcionális alhálózatban volt megfigyelhető (Df, Rf), illetve ahol ii) a változás a funkcionális és a kereszt hálózatokban (Df és Dc, Rf és Rc) is statisztikailag szignifikáns volt (Függelék 7. táblázat).

Eredményeink alapján 4 órával a transzdukció után az általános alacsony interaktivitás ellenére bizonyos funkcionális alhálózatok, mint a virális folyamatok, protein kináz kötődés, több szervezetet érintő folyamatok, de novo fehérje feltekeredés, stb. statisztikailag szignifikáns mértékben megnövekedett interaktivitás mutattak.

12 órával a transzdukció után a kép változott, ugyanis a hálózat méretének csökkenése ellenére az interaktivitás nőtt, amely többek között olyan funkcionális alhálózatoknak volt tulajdonítható, mint az RNS kötés, RNS katabolikus folyamatok, virális életciklus, virális folyamatok, fehérje feltekeredés, metabolizmus, sejthalál gátlása stb.

A szakirodalomban számos publikáció taglalja a HIV-1 – gazdasejt kapcsolatot, és annak megváltozását a fertőzés során. RNS interferencia segítségével több mind ezer génterméket azonosítottak eddig, mint fontos faktort, a HIV-1 fertőzés során [439–444]. Egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy HIV-1 fertőzés után a korai időpontokban egy általános represszió figyelhető meg; a sejtmagi fehérjéket, DNS replikációban és fehérje szintézisben résztvevő fehérjéket kódoló gazdasejt gének gátlódnak [438]. Ezt az általános gátlást a mi adataink is bizonyítják. Génaktivációt általában csak a vírusfertőzés későbbi időpontjaiban sikerült kimutatni; a fertőzés után 22 órával volt a legmagasabb a génkifejeződés a fertőzött gazdasejtben [438,445]. T limfociták elemzésekor a fertőzés után 24 órával figyelték meg a legnagyobb változások a sejt proteómjában [445]. Különböző tanulmányokban eddig

körülbelül 300 gazdasejt gént azonosítottak, amelyek a HIV-1 életciklusához elengedhetetlenek, de az egyes munkacsoportok eredményei között jelentős eltérések tapasztalhatók [441–443,446,447].

Mivel a kutatások nagy része a későbbi időpontokat célozza meg, munkánk során a korai időpontokra, a 0-12 óra intervallumra vonatkozóan próbáltunk adatokat gyűjteni. A súlyozott hálózat generálása és a funkcionális alhálózatok tanulmányozása segítségével információt nyerhettünk a fehérje változások dinamikájáról a 4 óra és 12 óra időpontokban. A várakozásoknak megfelelően, a nagyon korai fázisokban a transzlációban, transzkripcióban, DNS kondenzációban részt vevő fehérjék (HIST1H1E, HNRNPL, PRRC2A, TRIM28) mennyisége megnőtt. Az RNS kötésben, citoszkeleton összeszerelésben/átrendeződésben és szignalizációban szerepet játszó fehérjék (ALYREF, CCDC86, CSDA, COX5A, HN1, MYL6, PPIF, SEPT2, SRSF6, TCOF1, TPM3) pedig nem voltak kvantitálhatók a HIV-1 kezelt, 12 órás mintákban.

A hálózatelemzés adatait értelmezve az „RNS kötés”, „RNS katabolizmus”,

„sejtkomponens összeszerelés” és „virális folyamatok” funkciók megnövekedett aktivitását figyelhettük meg. Ugyanakkor az „apoptotikus folyamatok negatív regulációjának”

növekedését is sikerült megfigyelni, ami tulajdonképpen egyenértékű az apoptózis gátlásával.

Más kutatócsoportok is kimutatták a megnövekedett RNS kötést a vírusfertőzés hatására;

Garcia-Moreno és mtsai. nagy aktivitású RNS kötő fehérjéket azonosítottak sindbis vírus (SINV) fertőzés hatására a fertőzés után 18 órával [448]. Azt is kimutatták, hogy megnő az RNS kötő fehérjék kötődése a vírus RNS-hez. Ez azt jelenti, hogy a gazdasejt mRNS-ei jelentős mértékben gátlódnak, ami elsősorban a sejt normál működéséért felelős homeosztatikus géneket érinti [448]. siRNS kísérletekkel bizonyították, hogy a gazdasejt fehérjéinek jelentős része az mRNS transzportban vesz részt [443].

A HIV-1-el fertőzött sejtek általában apoptózis révén elhalnak, de az apoptózis gátlása a vírus által segíthet a vírus rezervoir fenntartásában [449]. A fertőzött immunsejtek egy része túlél, jelezve, hogy menyire fontos a vírus rezervoár kialakításában és fenntartásában az apoptózistól való megszabadulás [449]. Mohammadi és mtsai. a fertőzés utáni korai időpontokban nem egyértelmű gátlást vagy aktiválást, hanem egy kevert mintázatot figyeltek meg az antivirális védekezésben és sejthalál szignalizációban szerepet játszó gének esetében [438]. Az apoptózis gátlása elősegíti a vírustermelést a HIV-1 által fertőzött sejtekben [450]

és amennyiben lehetőség nyílik rá, a fertőzött sejtek apoptózisának módosítása egy jó terápiás megközelítés lehet [451].

A gazdasejt genomjának kijátszása a HIV-1 által a fertőzés egy komplex folyamata. A korai szakaszban a vírus a sejt fehérjéit használja a saját replikációjához. 15 órával a fertőzés után már a fertőzött sejt által termelt összes transzrkiptum a vírus genomjáról származott és 18 órával a fertőzés után a sejt elkezdte kibocsátani a vírusokat [440]. Új generációs szekvenálás segítségével kimutatták, hogy 12 órával a fertőzés után jelentősen megnő a virális mRNS szint a fertőzött sejtekben [452]. A vírus RNS és fehérjék termeléséhez a vírus a gazdasejt fehérjéit használja. Eredményeink is azt mutatták, hogy az RNS kötés, RNS katabolizmus és fehérje feltekeredés megnövekedett a HIV-1 kezelt sejtekben 12 órával a kezelés után. Kleinmann és mtsai. újraelemezték Chang és mtsai. által közölt adatsorokat és azt találták, hogy a fertőzés utáni 12 órás minták génexpressziós profilja nem tér el jelentősen a kontroll génexpressziós profiljától. Szerintük, az adatokból egyértelmű következtetéseket csak 24 órával a fertőzés után lehet levonni [453]. Eredményeik felhívják a figyelmet az érzékenyebb technikák kifejlesztésének szükségességére.

Nagyon nehéz megfelelően összehasonlítani eredményeinket az irodalomban közölt adatokkal, ugyanis a kutatások jelentős része a fertőzés utáni későbbi időpontokat (2 nap, 6 nap) vizsgálja, és kevés adat áll rendelkezésre a 12 óra körüli vagy előtti időpontokról [441,454,455]. A rendelkezésre álló adatokat felhasználva eredményeink jó egyezést mutatnak a szakirodalomban közölt adatokkal a fertőzés korai szakaszát illetően. Ugyanakkor azt is ki kell hangsúlyozni, hogy kísérleteinket humán embrionális vesesejteken és nem immunsejteken végeztük el. Mivel bizonyítani tudtuk, hogy a módszerünk megfelelően működik, a továbbiakban meg kívánjuk ismételni transzdukciós kísérleteinket Jurkat vagy THP-1 sejtek felhasználásával.

A munkánk során kifejlesztett súlyozott hálózatkészítő- és elemző módszer megfelelően használható biológiai minták proteómjának elemzésére, a kvalitatív és kvantitatív adatok együttes kezelésére és ezáltal hozzásegíthet a komplex biológiai jelenségek megértéséhez.