Kaló Péter
2. Célkitűzés
Xanthomonas campestris pv. euvesicatoria baktériummal szembeni ellenállóságot biztosító recesszív bs6 lókusz genetikai térképezését tűztük ki célul, mert munkánk hosszú távú célja a bs6 gén térképezésen alapuló izolálása. Az Xcv rezisztenciáért felelős bs6 gén azonosításához egy paprika SSR marker készlet segítségével az F2 szegregáló populáció egyedeinek fenotípus és genotípus meghatározásával durva genetikai térképet szerettünk volna készíteni, amin meghatározzuk a bs6 lókusz kromoszóma pozícióját. A szegregáló populáció kiterjesztésével és további genetikai markerek alkalmazásával, valamint a paprika genomszekvencia segítségével újabb genetikai markerek fejleszthetők, amelyekkel tovább pontosítható a bs6 gén térképhelye.
3. Módszerek
3.1 Szegregáló populáció létrehozása keresztezéssel
A bs6 recesszív rezisztencia gén vizsgálatához a Capsicum annuum PI 271322 USDA génbanki tételt (PI271322 USDA) és a rezisztenciát először leíró floridai kutatócsoporttól beszerzett
annuum (Fö5) anyanövényekkel. A keresztezésből származó, kiszelektált hibrid F1 egyedek önbeporzásával hoztuk létre az F2 szegregáló populációt.
3.2 Fenotipizálás
A kutatásunkhoz szükséges referencia populáció előállításához felhasznált szülői egyedeken, majd a keresztezésből származó F1, illetve azok önbeporzásából származó F2 populáción is elvégeztük az Xcv baktérium (különböző avirulencia faktort hordozó) törzsekkel történő fertőzését. Ehhez a baktériumokat YDC (Yeast extract-dextose-CaCO3 agar) lemezeken két napig növesztettük 30◦C-on. Ezt követően a sejteket steril vízben oldottuk, a megfelelő fertőzés érdekében megmértük és optimalizáltuk a szuszpenzió OD értékeit. Egy-egy alkalommal 45-50 db növény öt-öt levelét beszámoztuk és a megfelelő törzsekkel fertőztük (2. ábra). A fertőzést követően a növényeket kontrollált körülmények között (25◦C, 16/8 órás fotoperiódus) tartottuk. Egy hét elteltével elvégeztük a fertőzés fenotípusos kiértékelését.
2. ábra: Az infiltrálás folyamata sérülésmentes módszerrel
3.3 Genotipizálás
A paprika genotípusok molekuláris jellemzéséhez az előzetes fertőzési fenotípus alapján kiválasztásra került szülők és a keresztezésekből származó F1 utód növények leveleiből Zenogene növényi DNS tisztító kit segítségével izoláltunk összDNS-t. Az egyedek genotípusait bs6 rezisztencia lókusz durva genetikai térképezéséhez mikroszatellit (SSR) markerekkel határoztuk meg. A szülőkön előzetesen tesztelt polimorf markerekkel kezdtük el az F2 populáció genetikai térképezését. A szegregáló F2 populáció egyedeinek DNS-eivel PCR reakciókat állítottunk össze. A PCR termékeket 2 %-os NuSieve agaróz gélelektroforézissel választottuk el egymástól. A genotípus meghatározásokat követően a genotípus adatokat excel táblázatban összesítettük és a markerek kapcsoltságát az ún. színtérképezés módszerével vizsgáltuk.
3. ábra: A genotipizálás folyamata biotechnológiai módszerekkel (DNS izolálás, PCR reakció, agaróz gélelektroforézissel a polimorfizmusok detektálása)
3.4 Színtérkép szerkesztése
A színtérkép mátrixában a populáció egyedeinek különböző markerekre adott összevont genotípus adatait rögzítettük. Az oszlopokban egy-egy adott növény, a sorokban egy-egy markernek az oszlopban szereplő növényre vonatkozó genotípus adatai tüntettük fel. A különböző genotípusokat színekkel és számokkal jelöltük. Minden függőleges színátmenet egy-egy rekombinációs eseményt jelöl. A markerek sorait úgy rendeztük egy-egymás alá, hogy azok a lehető legkevesebb rekombinációt, azaz színátmenetet mutassák [9].
4. Eredmények
Az Xcv baktériummal szemben feltehetően rezisztenciát biztosító, bs6 génnel kapcsolt markerek fejlesztéséhez megkezdtük a genetikai térképezést. A különböző F1 (13-as, 16-os, 25-ös és 36-os keresztezések) növények önbeporzásából kapott 50-60 db F2 növényt Xcv baktérium különböző rasszaival infiltráltuk, majd az Xcv fertőzésre adott fenotípusaikat kiértékeltük. Az F2 utódok azon csoportjaiban, ahol a fertőzésre adott fenotípusok mutatták az elvárt 3:1 hasadási arányt, kiválasztottunk Xcv fertőzéssel szemben rezisztens és szenzitív egyedeket. A referencia populációt adó F2 növényeket használtuk a bs6 rekombinációs térkép elkészítéséhez. Ehhez a SSR markereket előzetesen a szülőkön és az F1 hibrideken teszteltük.
A szülők között polimorfizmust mutató markerekkel elvégeztük a szegregáló populáció egyedeinek genotípus meghatározását. Ezt követően a vizsgált markerek egymáshoz, illetve a bs6 rezisztencia lókuszhoz való kapcsoltságát színtérképpel elemeztük. A színtérkép segítségével a vizsgált régióban rekombináns növényeket – amelyek a térképezés szempontjából a leginformatívabbak – egyszerűen ki tudtuk választani. A kapcsoltság azonosítását követően a további genetikai markerek esetében már csak a vizsgált régióban rekombináns 43 darab növény genotípusát vizsgáltuk tovább.
A genotípusok és az Xcv fertőzésre kapott fenotípus genetikai analízise alapján a bs6 rezisztencia lókusz a paprika kromoszómái közül csak az egyiken található markerekkel mutattak kapcsoltságot. Ennek ellenére a bs6 lókusz pontosabb genetikai térképezéséhez újabb SSR markerek tervezése szükséges, amelyeket a vizsgálat előrehaladása során folyamatosan tesztelünk.
5. Összefoglalás
Csoportunk egyik kutatási témája a paprika Xcv baktériummal szembeni rezisztenciájának vizsgálata, amihez létrehoztunk F2 szegregáló populációkat és megkezdtük a bs6 lókusz genetikai térképezést. Kutatásunk során SSR markereket terveztünk és teszteltünk. A paprika kromoszómákra specifikus SSR markerekkel meghatároztuk a szülői és a kiválasztott F2 utódok genotípusát. Lokalizáltuk a rezisztencia gén térképhelyének elsődleges pozícióját. A továbbiakban folytatjuk az Xcv recesszív rezisztenciáért feltehetően felelős gén jelölt (bs6) azonosítását és szekvenciájának meghatározását.
Irodalomjegyzék:
[1] BURGYÁN J., KLEMENT Z. (1979): Early induced selective inhibition of incompatible bacteria in tobacco plants. Phytopathol. Medit., 18: 153–161.
[2] CHISHOLM S. T., COAKER G., DAY B., STASKAWICZ B. J. (2006): Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cell, 124(4): 803–814.
[3] Cox RS, Conover RA, Sowell G Jr. 1956. Symptomology of bacterial spot of tomato and pepper in southern Florida. Phytopathology 46:582–84
[4] Fehér, B. (2007) A csemegepaprika termesztése és jelentősége. MezőHír IX. évfolyam 2007/1:72-75
[5] Gassman W, Dahlbeck D, Chesnokova O, Minsavage GV, Jones JB, Staskawicz BJ.
2000. Molecular evolution of virulence in natural field strains of Xanthomonas campestris pv.
vesicatoria. J. Bacteriol. 182:7053–59
[6] Hafez, Yasser M. - Király, Z. (2003): Role of Hydrogen Peroxide in Symptom Expression of Barley Susceptible and Resistant to Powdery Mildew. Acta Phytopatologica et Entomologica Hungarica. 38, 227-236
[7]Jones, J.D.G – Dangl, J.L. (2006): The plant immune system. Nature 444: 323-329. pp.
[8] Kearney B, Staskawicz BJ. 1990. Widespread distribution and fitness contribution of Xanthomonas campestris pv. vesicatoria avirulence gene avrBs2. Nature (Lond.) 346:385–86 [9] Kiss G. B., Kereszt A., Kiss P., Endre G. (1998): Colormapping: A non-mathematical procedure for genetic mapping. January 1998Acta Biologica Hungarica 49(1):125-142.
[10] Klement Z, Farcas GL, Lovrekovich L. 1964. Hypersensitive reaction induced by phytopathogenic bacteria in tobacco leaf. Phytopathology 54:474–77
[11] Klement, Z. (2004). Önvédelem a Növényvilágban. Mindentudás Egyeteme 2., Kossuth Kiadó, Budapest
[12] Minsavage GV, Dahlbeck D, Whalen MC, Kearney B, Bonas U, et al. 1990. Gene-for-gene relationships specifying disease resistance in Xanthomonas campestris pv. vesicatoria—
pepper interactions. Mol. Plant- Microbe Interact. 3:41–47
[13] Morgues F, M-N. Brisset, and E. Chevreau (1998): Strategies to improve plant resistance to bacterial diseasethrough genetic engineering. Tibtech. 16: 203-210.
[14] Ronald PC, Staskawicz BJ. 1988. The avirulence gene avrBs1 from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria encodes a 50-kD protein. Mol. Plant-Microbe Interact. 5:191–98
[15] Szarka J. & Csilléry G. (1995): Defense system against Xanthomonas campestris pv.
vesicatoria. Eucarpia IXth Meeting on Genetics and Breeding on Capsicum and Eggplant, Budapest, Hungary, August 21-25, 1995.: 184-187.
[16] Szarka J. és Csilléry G. (2001b): General defense system int he plant kingdom II. Int.
Jour. Hort. Sci. 7 (3-4) 73-77.
[17] Szarka J., Toldi O., Szarka E., Remenyik J. és Csilléry G. (2006): General Defense Reaction in the Plant Kingdom. Acta Agr. Hung. 54. 221-232.
[18]Thomas WDJ and Weinhold AR (1953): Xanthomonas striaformans, a new bacterial pathogen of onion. Journal of the Colorado-Wyoming Academy of Science 4, 23.
[19] Vallejos CE1, Jones V, Stall RE, Jones JB, Minsavage GV, Schultz DC, Rodrigues R, Olsen LE, Mazourek M. (2010): Characterization of two recessive genes controlling resistance to all races of bacterial spot in peppers. Theor Appl Genet. 2010 Jun;121(1):37-46.
Lektorálta: Dr. Kondrák Mihály, egyetemi adjunktus, Széchenyi István Egyetem, Növénygenetikai, Növénynemesítési és Növénybiotechnológiai Csoport