Pour le complexe C3, les spectres UV-vis sont quasiment identiques dans le MeOH et le CH2Cl2. La coordination Npy→CuII induit un effet hypsochrome sur la bande située à 230 nm du ligand L3. Trois bandes sont encore observées, la transition π→π* à 260 nm, la LMCT de R-O-→ CuII à 360 nm dans le CH2Cl2 (380 nm dans le MeOH) et la transition d-d à 680 nm. Elles indiquent une géométrie de pyramide à base carrée.58
Sur le spectre d’IR du complexe C3, nous observons les déplacements des bandes ν(C=N), ν(C-Cpyridine) et γ(C-Hpyridine) du ligand L3 vers la haute énergie (∆ν=20 cm-1) qui suggère la coordination de l’ion cuivrique. La bande de ν(O-H) vers 3400 cm-1 n’est pas présente car le groupement hydroxyle est déprotoné dans le complexe C3. Les bandes du triflate sont intenses et masquent la bande de ν(C-O) vers 1050 cm-1.
Le complexe est silencieux en RPE. Ce résultat est en accord avec un couplage antiferromagnétique entre les deux ions cuivriques. Le moment magnétique (µeff=1.35 BM) confirme ce résultat (µeff=1.7-2.2 BM pour le complexe monocuivrique).
Le voltammogramme cyclique de C3 mésurés en solution méthanolique contenant 0.1 M TBAP dans le domaine de -1.0-1.2 V vs. Ag/AgCl à l’électrode de travail en platine est présenté sur la Fig.20/b et il ne montre pas de vagues réversibles. Un seul pic de réduction est observable à 60 mV vs. Ag/AgCl. Le pic anodique d’oxydation situé à 400 mV peut être correspondant au processus passé sur la surface en incluant de Cu0.
Le complexe C3 a été cristallisé par diffusion d’éther à –18°C dans une solution de CH2Cl2 saturée en C3. Il cristallise dans un système orthorhombique ayant le groupe d’espace Pnma avec des paramètres de maille suivants: a=16.9950(2) Å, b=23.2200(2) Å, c=11.0680(4) Å, V=4367.7(2) Å3. Le cuivre est pentacoordiné dans une géométrie de pyramide à base carrée faiblement déformée avec la valeur de τ=0.17 (Fig. 22). Les paramètres géométriques autour de cuivre sont présentés dans le Tab. 8.
Chapitre II. – Synthèse et caractérisation des complexes cuivriques
Figure 22. Structure du complexe C3.
Tableau 8. Principales distances (Å) et angles (°) autour des cuivres dans le complexe C3.
Distances (Å) Angles (°) Angles (°)
Cu1 N1 2.032(3) N1 Cu1 N3 98.93(14) O1 Cu1 N1 87.04(12) Cu1 N2 2.009(3) N2 Cu1 N3 95.40(10) O1 Cu1 O2 90.54(12) Cu1 N3 2.179(4) O1 Cu1 N3 104.69(11) N1 Cu1 O2 165.31(15) Cu1 O1 1.9695(12) O2 Cu1 N3 95.71(16) O1 Cu1 N2 159.45(14) Cu1 O2 2.047(3) N2 Cu1 O2 83.10(13) Cu1 O1 Cu2 139.82(18) Cu1 Cu2 3.699(3) N2 Cu1 N1 94.17(12) Cu1 O2 S1 135.24(11) S1 O2 1.430(3)
La base de la pyramide est définie par deux azotes pyridiniques, l’oxygène de groupement alcoolate du ligand et l’oxygène de contre ion de triflate qui est pontant entre les deux cuivres(II). Les deux cuivres sont en rélation par plan de miroir cristallographique contenant les atomes O1, C1, S1, C17. La distance intermétallique est 3.699 Å qui est plus grand que le complexe dérivé de 2-hydroxy-1,3-diaminopropane par Karlin et coll.61 Dans la pyramide à base carrée la distance de hors de plan du plan basal construit par les atomes O1, O2, N1, N2 est 0.045 Å, celle incluant l’atome Cu1 est 0.127 Å.
Chapitre II. – Synthèse et caractérisation des complexes cuivriques
41 II. 3. 2 Propriété acido-basique
Nous avons effectué aussi des titrations photométriques et potentiométriques du complexe C3. Les données caractéristiques du spectre UV-vis mesuré dans l’eau (0.2 M KCl) sont présentées dans le Tab. 9.
Tableau 9. Les absorbances caractéristiques des différents complexes cuivriques dans H2O.
Structure Npy →Cu(II),π→π* LMCT Transition d-d C1 tétragonale 200, 260 nm 370 nm
(épaulement) 676 nm C2 bipyramide à
base trigonale 200, 260 nm - 703 nm C3 tétragonale 200, 260 nm 370 nm
(épaulement) 670 nm
A. Titration photométrique
Lors de la titration photométrique, nous avons suivi les changements d’absorbances (ε) à ces quatre bandes caractéristiques (203, 260, 365 et 650 nm). Les courbes expérimentales sont présentées sur la Fig. 23.
Pour les bandes à 203 (Npy →CuII) et 260 nm (π→π*), les principaux changements sont observés entre les pH 2 et 3.5. Pour la bande à 365 nm (LMCT, RO-→CuII), nous observons une augmentation de l’absorbance jusqu’au pH 3.5 suivie d’une très nette diminution au-delà de ce pH. D’autre part, le spectre UV-vis présente un point isosbestique à 380 nm (Fig. 24) indiquant un équilibre entre deux espèces.
Le même effet a pu être observé pour la bande à 670 nm (d-d). En effet, entre les pH 2 et 4 l’absorbance à 670 nm augmente en même temps que le maximum se déplace vers des énergies plus élevées (695 nm→670 nm, Fig. 25). Pour un pH > 3.5, un point isosbestique se précise à 680 nm (Fig. 24).
Au-delà de pH 5, l’effet du pH est pratiquement nul sur les transitions Npy →Cu(II), π*
→
π et d-d. Il est également très faible sur la LMCT, pour laquelle une légère augmentation de l’absorbance peut être observée à pH > 7.
Chapitre II. – Synthèse et caractérisation des complexes cuivriques
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000
2 3 4 5 6 7 8
pH
203, 260 nm
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000
365, 650 nm
203nm 260nm 365nm 650nm
ε ε
Figure 23. Titration photométrique à 40°C du complexe C3 en fonction du pH aux différentes absorbances.
Figure 24. Fraction du spectre UV-vis du complexe C3 pour une concentration de 2.5×10-3 M dans KCl(0.2 M) entre les pH 3.5 et 6.5.
B. Titration potentiométrique
En ajoutant l’acid à la solution du ligand L3 neutre, il prend six protons H6L6+ (les six azotes sont protonés). La forme protonée du ligand perde ces protons en titrant par la soude dans le domaine mesurable du pH. Il en perd quatre au dessous du pH 5.0
Absorbance
Longeur d’onde
Chapitre II. – Synthèse et caractérisation des complexes cuivriques
43
(pK1 << 2, pK2 =2.66(2), pK3 =3.41(5), pK4 =4.25(5)), deux jusqu’au pH 9.0 (pK5 =5.83(7), pK6 =7.92(1)). Le groupement -OH ne perd pas de proton dans ce domaine du pH (Fig. 26/a).
Figure 25. Fraction de spectre UV-vis du complexe C3 pour une concentration de 2.5×10-3 M dans KCl (0.2 M) entre les pH 2.5 et 4.0.
Les complexes binucléaires formés sont très stable, ils ne se précipitent pas en présence de deux fois plus de Cu2+. Le courbe de titration peut être bien ajusté par les composés [Cu2L3]4+, [Cu2L3H-1]3+ és [Cu2L3H-2]2+ (l’erreur du fitting est 2×10-3 cm3). Les constantes de stabilité (logβ) sont les suivantes: [Cu2L3]4+: 17.88(2), [Cu2L3H-1]3+: 14.14(6), [Cu2L3H-2]2+: 8.00(6) (Fig. 26/b).
En solution aqueuse à 40°C, il s’agit d’un équilibre entre 3 composants dont les concentrations relatives sont dépendantes du pH.
En examinant les résultats des titration photométrique et potentiométrique, nous pouvons constater que
1. selon les changements d’absorbance à 203, 260 et 365 nm, la formation du complexe binucléaire [Cu2L3]4+ est terminé jusqu’à pH~3.
Duggan et coll.62 ont décrit la différence des spectres UV-vis des complexes cuivriques aux structures tétragonale et bipyramide à base trigonale.
Ils ont constaté que pour la structure tétragonale, l’énergie de la transition d-d est plus grande que pour la structure bipyramide à base trigonale. Nous avons donc étudié le spectre UV-vis du complexe Cu2L2(CF3SO3)2 (C2) en solution aqueuse contenant du KCl (0.2 M). Les données caractéristiques sont résumées dans le Tab. 9.
Absorbance
Longeur d’onde
Chapitre II. – Synthèse et caractérisation des complexes cuivriques
2 4 6 8 10 12
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 KOH [cm3]
pH
a. b.
Figure 26. Titration potentiométrique à 40°C du ligand L3 par KOH en absence (a) ou en présence (b) de 2 eq. de Cu(CF3SO3)2.
Conditions: [L3]=5×10-3 M, [Cu2+]=1×10-2 M, [KCl]=0.2 M, [KOH]=0.1941 M.
En comparant les caractéristiques des sphères de coordination de C2 et C3, on peut constater que la transition d-d à 703 nm pour le complexe C2 est déplacée à 670 nm pour le complexe C3, ainsi la bande à 365 nm n’est pas observable pour C2 ce qui confirme que cette absorbance correspond à la transition de R-OH→Cu(II). Nous avons déjà présenté la structure RX de cristal C2 préparé de l’eau dans le Chapitre II (Fig. 22) dont les cuivres possèdent une géométrie bipyramide à base trigonale.
2. Dans la structure du composé [Cu2L3]4+ le groupement hydroxyl du ligand est coordiné à l’un des deux cuivres(II) et la géométrie autour des cuivres(II) est bipyramide à base trigonale qui change en tétragonale par coordination de ROH et à pH > 3.0 par formation de l’espèce [Cu2L3H-1]3+.
3. RO- est coordiné aux cuivres(II) par deprotonation de ROH (pK 3.7), l’absorbance à 365 nm augmente jusqu’à l’apparition du composé [Cu2L3H-2]2+.
4. Au delà du pH~4.5, l`absorbance à 365 nm diminue qui peut correspondre à la coordination de RO- et le pont oxo formé par deprotonation d’un molécule d’eau coordinée au cuivre(II). La structure plus rigide de [Cu2L3H-2]2+ par rapport à celle de [Cu2L3H-1]3+
peut être l’explication de tel changement. Maloney et coll. ont observé tel changement pour le complexe binucléaire à cuivre du ligand de
2,6-bis(bis(2’-pyridyl-Chapitre II. – Synthèse et caractérisation des complexes cuivriques
45 methyl)aminoethyl)-4-methylphénole, Hbpmp.63
5. Au delà du pH 8.0 on n’observe pas d’autre deprotonation.
Les structures proposées pour ces composants et leur distribution équilibrée en fonction du pH sont présentées sur la Fig. 27 et 28.
Figure 27. Structures proposées pour le complexe C3 en fonction du pH.
0
Figure 28. Concentrations relatives des composants du complexe C3 en équilibre en fonction du pH et à 40°C.
CHAPITRE III
ACTIVITE PHOSPHATASE DES COMPLEXES C1 ET C3
Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3
46
III. ACTIVITÉ PHOSPHATASE DES COMPLEXES C1 ET C3
L’activité phosphatase des complexes C1 et C3 ont évalué tout d’abord dans la transestérification d’un substrat modèle d’ANR, le phosphate de 2-hydroxypropyle et de p-nitrophenyle (HPNP) puis dans l’hydrolyse d’un substrat modèle d’ADN, le phosphate de bis-p-nitrophenyle (BNPP) (Fig. 29).
Les expériences ont été réalisées à 40 °C en milieu aqueux tamponné (MES pH 5.5-6.5, HEPES pH 7.0-8.0, EPPS pH 8.5, 50 mM). Les constantes de vitesse du pseudo premier ordre ont été calculées à partir de la formation du produit de la réaction, le p-nitro-phenolate (PNPate).
Figure 29. Substrats utilisés dans l’étude d’activité phosphatase des complexes C1 et C3.
La quantité de PNPate formée au cours du temps a été déterminée par la spectroscopie d’absorption UV-vis à 400 nm. Dans ce calcul, nous avons tenu compte de l’équilibre de PNP/PNPate dépendant du pH. Une constante d’équilibre (pKa) a été déterminée par la titration photométrique du PNP à 400 nm dans la même condition que la réaction. Après ajustement théorique de la courbe expérimentale, un pKa de 7.15 a été déterminé. Sur la base de cette valeur, la concentration totale de [PNPate] peut être calculée maintenant et évaluée à partir des Eq.1 et 2.
Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3 La constante de premier ordre kobs et seconde ordre k2 sont définies par l’Eq. 3.
0
Afin de déterminer les paramètres cinétiques du clivage des phosphodiesters, nous avons appliqué le modèle de Michaelis-Menten (Eq. 4).
]
Où KM désigne la constante de Michaelis-Menten, Vm la vitesse maximale et kcat la constante de vitesse ou turnover. Pour déterminer la meilleure condition de la réaction et préciser l’équation cinétique, la vitesse initiale a été mesurée en fonction du pH et des concentrations du substrat et du complexe en condition du pseudo premier ordre. Les données cinétiques présentées sont des moyennes de trois (certain cas de deux) mesures et l’erreur relative est moins de 10%.
III. 1 Activité phosphatase du complexe mononucléaire C1
Nous avons étudié la transestérification de HPNP et l’hydrolyse de BNPP catalysées par le complexe C1. Sur la Fig. 30 est représentée une cinétique typique de clivage. Toutes les données mesurées et calculées sont présentées dans le Tab. 10 pour le HPNP et dans le Tab. 11 pour le BNPP.
Figure 30. Transestérification du HPNP par C1 à pH 6.0.
Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3
48
Tableau 10. Données de la transestérification du HPNP (*1.85×10-3 M) accéléré par le C1 à 40 °C.
Nous avons tout d’abord examiné l’effet du pH sur l’activité du complexe C1. Les expériences ont montré que celle-ci est faiblement influencée par le pH du milieu réactionnel (Fig. 31, Tab. 10. Entrée 1-6, Tab. 11. Entrée 1-6).
En comparant la courbe du kobs vs. pH et la distribution du complexe C1 dans l’eau (Fig. 17, 31), nous pouvons conclure que le complexe le plus actif est la forme [CuH-1L1(H2O)]+. En faisant la comparaison à pH 7.0 avec les valeurs de k2 des composés modèles présentés dans la partie bibliographique, nous pouvons dire que notre complexe C1 est moins actif par rapport aux modèles 2, 6, 7 et montre similaire activité par rapport au 4 dans la transestérification de HPNP. Dans l’hydrolyse de BNPP il est plus actif par rapport au modèles 1, 4, 7. Le modèle 5b qui a une structure similaire à celle de C1 montre plus activité (Tab. 4).
Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3
kobs-kuncat [s-1 ] / 106 BNPP
[CuH-1L1(H2O)]+ HPNP
Figure 31. Dépendance de kobs vs. pH pour la transestérification du HPNP et l’hydrolyse du BNPP à 40°C en comparant à la concentration relative de [CuH-1L1(H2O)]+.
Conditions: [HPNP]=[BNPP]=1.94×10-4 M, [C1]=4.84×10-4 M.
Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3
50
III. 1. 2 Effet de la concentration du substrat
A partir des données expérimentales, des courbes de saturation sont obtenues (Tab. 10. Entrées 11-19, Tab. 11. Entrée 11-17) en indiquant la formation du complexe substrat-C1 en preéquilibre suivi la transformation du substrat selon le modèle de Michaelis-Menten. Sur la Fig. 32 est représentée cette courbe pour la transestérification du HPNP. D’après l’ajustement par la méthode des moindres carrés, les valeurs de KM, Vm, kcat et kcat/KM ont été calculées et résumées dans le Tab. 12.
Figure 32. Courbe de cinétique de saturation de la transestérification du HPNP par le complexe C1 à pH 7.0. Conditions: [C1]=5×10-4 M, T=40 °C.
Tableau 12. Données calculées des courbes de saturation pour le C1 à pH 7.0.
[CuH-1L1(H2O)]=0.89[C1] BNPP 5.95±1 6.48±2 1.38±0.22 0.21 HPNP 21.6±5 8.30±2 4.85±1 0.58
Nous pouvons conclure que l’hydrolyse du BNPP est 3.6 fois moins rapide que la transestérification du HPNP catalysée par le complexe C1. En faisant la comparaison avec les valeurs de kcat/KM des composés modèles présentés dans la partie bibliographique (modèles 1, 2, 3), nous pouvons dire que notre complexe C1 montre plus activité dans
Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3 l’hydrolyse de substrat modèle d’ADN par rapport au 1, similaire activité par rapport au 2 et il est moins actif que le modèle 3 (Tab. 4).
III. 1. 3 Effet de la concentration du complexe C1
Nous avons étudié la fonction du Vi vs. [C1] (Tab. 10, 11. Entrées 7-10) à pH 7.0 pour déterminer l’ordre partiel du complexe dans l’équation cinétique. Pour les deux substrats, des cinétiques du premier ordre ont été obtenues, indiquant que le complexe actif est mononucléaire.
III. 2 Activité phosphatase du complexe binucléaire C3
Sur la Fig. 33 est représentée une cinétique typique d’hydrolyse catalysée par le complexe C3.
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.014 0.016 0.018
0 50 100 150 200
t [min]
Absorbance (400nm)
Figure 33. Transestérification du HPNP par le complexe C3 à pH 6.0.
Conditions: [HPNP]i=1.95×10-4 M, [C3]=4.86×10-4 M, T=40 °C.
Les Tab. 13 et 14 rassemblent respectivement les données expérimentales pour la transestérification du HPNP et l’hydrolyse du BNPP catalysées par le complexe C3. Ils incluent: les vitesses initiales et les constantes kobs, kuncat non accélérée et k2 en second ordre.
Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3
52
Tableau 13. Données cinétiques de la transestérification du HPNP (*1.85×10-3 M) catalysée par le complexe C3 à 40 °C.
Les kobs du clivage des phosphoesters en fonction du pH ont été déterminées (Tab. 13. Entrée 1-7, Tab. 14. Entrée 1-7).
Les profils différents ont été obtenus par rapport au complexe mononucléaire C1, l’activité du complexe C3 présente un maximum à pH 6 pour la transestérification du HPNP et l’hydrolyse du BNPP (Fig. 34).
Selon les valeurs de k2 calculées à différent pH on peut constater que notre complexe C3 est moins actif que les modèles binucléaires présentés dans la partie bibliographique (Tab. 4).
Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3 Tableau 14. Données cinétiques de l’hydrolyse du BNPP (*1.92×10-3 M) catalysée par le
complexe C3 à 40 °C.
Figure 34. Dépendance de pH vs. kobs pour la transestérification du HPNP et l’hydrolyse du BNPP à 40 °C en comparant à la concentration relative de [Cu2H-1L3(H2O)2]3+.
Conditions: [HPNP]=[BNPP]=1.95×10-4 M, [C3]=4.88×10-4 M.
Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3
54
Sur la Fig. 34 les concentration relatives des differents complexes en fonction du pH sont aussi représentées. Cette représentation démontre sans ambiguïté que la forme active du complexe C3 semble être celle où deux molécules d’eau et le groupement RO- du ligand sont coordinés aux atomes de cuivre, [Cu2H-1L3(H2O)2]3+ (Fig. 28, 34).
III. 2. 2 Effet de la concentration du substrat
Nous avons aussi étudié la variation de la vitesse initiale en fonction de la concentration du HPNP (Tab. 13. Entrées 12-20) et du BNPP (Tab. 14. Entrée 13-19).
Dans les deux cas, des courbes de saturations sont obtenues en condition de pseudo premier ordre démontrant le modèle de Michaelis-Menten. Les constantes KM, Vm et kcat
ont été déterminées par l’ajustement des données expérimentales avec la méthode des moindres carrés (Fig. 35).
Nous avons caractérisé l’activité du complexe C3 par le rapport de kcat/KM. Ce rapport permet une meilleure comparaison de l’efficacité de catalyseurs entre eux et par rapport à différents substrats. Toutes ces données sont rassemblées dans le Tab. 15.
0 25 50 75 100 125 150
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
[HPNP] [M] /103 Vi [Ms-1 ] / 1010
données mesurées courbe ajustées
y=193.5x/(0.6863+x)
Figure 35. Courbe de cinétique de saturation de la transestérification du HPNP par le complexe C3 à pH 6.0. Conditions: [C3]=5×10-4 M à 40 °C
Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3 Tableau 15. Données calculées des courbes de saturation pour le C3 à pH 6.0.
[Cu2H-1L3(H2O)2]=0.55[C3]
Vm [Ms-1] /1010
KM [M] /104
kcat
[s-1] /106
kcat/KM
[M-1s-1] /102 BNPP 30.15±1 1.55±0.2 11.0±3 7.10 HPNP 193.5±12 6.86±2 70.4±4 10.2
De ces résultats, nous pouvons conclure que le complexe C3 est 6 fois moins rapide dans l’hydrolyse du BNPP que dans la transestérification du HPNP (kcat 11.0 vs. 70.4×10-6 s-1).
En revanche, le BNPP présente une affinité plus grande pour le complexe C3 que le HPNP (KM 1.55 vs. 6.86×10-4 M). La valeurs de kcat/KM pour le BNPP est similaire à celle de modèles 10 (0.03 M-1s-1) présenté dans la chapitre bibliographique (Tab. 4).
III. 2. 3 Effet de la concentration du complexe C3
Les effets de la concentration du complexe en vitesses initiales de transestérification du HPNP et d’hydrolyse du BNPP ont été examinés à l’optimum de pH. Dans les deux cas, les cinétiques observées sont du premier ordre par rapport à la concentration en complexe C3, démontrant ainsi que le complexe C3 est actif sous forme dinucléaire (Tab. 13. Entrées 8-11, Tab. 14. Entrées 8-12).
III. 3 Discussion
Dans cette partie, nous allons comparer l’efficacité en phosphoester hydrolysis des complexes mono- et binucléaire C1 et C3.
Les deux complexes présentent une sphère de coordination équivalente constituée de deux atomes d’azote pyridinique, d’une amine tertiaire, d’un groupement alkoxyde et d’une molécule d’eau.
Des études acido-basiques effectuées sur les complexes diaquas ont mis en évidence la présence de 3 espèces différentes dont les concentrations relatives dépendent du pH.
L’activité phosphatase des complexes C1 et C3 a été examinée en fonction du pH et a démontré que les complexes actifs possèdent un groupement d’alkoxyde et une molécule d’eau liée sur les atomes de cuivre. La présence de cette molécule d’eau labile est
Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3
56
indispensable pour l’échange avec le groupement phosphodiester.
En comparant les kobs ou les périodes de demi-vie (t1/2=ln2/kobs) des substrats BNPP et HPNP obtenues pour les complexes C1 et C3, nous pouvons constater que le complexe mononucléaire C1 réagit ~14 fois moins vite pour le HPNP et 21 fois moins vite pour le BNPP que le complexe binucléaire à pH 6.0 et 40 °C (Tab. 16).
Nous pouvons aussi dire qu’en absence de complexes cuivriques, le HPNP est très stable (t1/2=134 jours) et qu’en présence de 5×10-4 M complexe binucléaire C3 il se clive vite, t1/2 de 0.4 jour à pH 6.0. Cela correspond à ~340 fois d’accélération de vitesse par rapport à l’autohydrolyse du substrat. Dans cas du BNPP, cette valeur est ~600. Pour le complexe mononucléaire C1, ces valeurs sont d’un ordre de grandeur plus faibles à pH 6.0.
Tableau 16. Accélération relative de vitesse de la réaction et la période de demi-vie des substrats en fonction du pH à 40 °C.
En général, l’étape qui exige la plus grande énergie est l’accès à l’état de transition qui détermine la vitesse de la réaction. Par le quotient de kcat/KM, la différence entre les énergies libres des états de transition (∆∆Gcomplexe-substrat‡) peut être calculée à température constante (Eq. 5).64
où les indices 1 et 2 se réfèrent à des substrats différents comparés pour un même complexe ou des complexes différents pour un même substrat. Avec cette analyse la contribution thermodynamique des composants structuraux particuliers au clivage peut être quantifier et l’efficacité des complexes comparer. La valeur positive ∆∆G‡ indique que le clivage du (substrat)2 est plus rapide (Tab. 17).
Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3 Tableau 17. La différence entre les énergies libres des états de transition en cas des
différents substrats.
∆∆Gcomplexe-substrat‡ ∆∆Gcomplexe-substrat‡
BNPP/HPNP C1/C3
C3 970 Jmol-1 BNPP 7950 Jmol-1
C1 2720 Jmol-1 HPNP 6200 Jmol-1
La valeur faible de ∆∆G‡ pour le complexe C3 indique que la coordination bidentate peut stabiliser l’état transition.
A partir de ces résultats nous pouvons conclure que la plus grande activité du complexe dinucléaire C3 par rapport au mononucléaire C1 réside dans l’effet synergique de deux atomes de cuivre.
Le clivage des phosphodiesters accéléré par le complexe mononucléaire se produit
1. par l’activation simple d’acide de Lewis (coordination monodentate au cuivre) en changant la molécule d’eau coordinée au cuivre(II),
2. suivi l’attaque du groupement hydroxyl sur le phosphore (Fig. 36).
Nous avons montré dans la Chapitre I. que Chin et coll. ont examiné la réactivité des complexes Cu-alkoxyde (modèles 5 a, b, c) et ils ont affirmé que selon la longueur de la chaîne d’alkoxyde l’hydrolyse ou transesterification peut se produire.31
Pour bien soutenir ce mécanisme proposé, nous avons effectué l’analyse d’HPLC en phase inverse (colonne C8, 1:1 MeOH/50 mM tampon phosphate, pH 7.0) pour identifier les produits et nous avons démontré que le complexe C1 n’accelère que l’hydrolyse de BNPP.
N Cu2+ O
Figure 36. Mécanisme proposé pour l’hydrolyse du BNPP catalysée par le complexe mononucléaire C1.
Dans le cas du complexe binucléaire C3, selon l’analyse de la propriété acido-basique, nous avons trouvé qu’il était le plus actif en forme diaquas [Cu2L3H-1(H2O)2]3+ à pH 6.0.
Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3
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Nous avons pu isoler en solution aqueuse et caractériser par diffraction des rayons X, le complexe de C3-BNPP représenté sur la Fig. 37. Dans ce complexe, les atomes de cuivre ont une géométrie pyramide à base carrée (τ=0.14 pour Cu1 et 0.26 pour Cu2). La base de la pyramide est définie par l’azote tertiaire, un des deux pyridines,
Nous avons pu isoler en solution aqueuse et caractériser par diffraction des rayons X, le complexe de C3-BNPP représenté sur la Fig. 37. Dans ce complexe, les atomes de cuivre ont une géométrie pyramide à base carrée (τ=0.14 pour Cu1 et 0.26 pour Cu2). La base de la pyramide est définie par l’azote tertiaire, un des deux pyridines,