IV. 2. 7 Discussion
VI. 9 Cinétique de l’oxydation de 3,5-di-tert-butylcatechol
Les expériences cinétiques ont été faites en MeOH dans un réacteur à thermostat. La température était constante à 25±0.1°C pendant la réaction. Le solvant utilisé a été saturé avec l’oxygène atmosphérique et la concentration de l’oxygène a été déterminée par les données de la littérature 79. La concentration de complexe C2 et C3 a été variée entre 0.6-5×10-4 M et celle du substrat entre 1.25-18.7×10-3 M. La formation du quinone a été suivie spectrophotométriquement à l’absorbance caractéristique de 400 nm (ε=1560 M-1cm-1). Après la réaction le produit a été isolé par l’extraction à l’hexane et a été caractérisé par la spectroscopie d’infra-rouge et le point de fusion par rapport un échantillon authentique. La formation de H2O2 a été suivie par la titration iodométrique.
La vitesse d’agitation était constante au cours des réactions pour éviter l’effet de contrôle de diffusion.
3,5-Di-tert-butylcatechol (DTBCH2)
La préparation de DTBCH2 a été faite par la méthode de Schulze.80
IR (KBr) : 3450, 3280 (νO-H), 3010 (νC-H aromatique), 2960-2910 (νas CH3), 2860 (νs CH3), 1590, 1500, (νC-Caromatique), 1360 (βOH), 1240-1210 (δCH3), 1160(νC-O(H)), 860 (γC-H aromatique, γC-C), cm-1.
Point de fusion 99-100°C.
3,5-Di-tert-butyl-1,2-benzoquinone (DTBQ)
La préparation de DTBQ a été faite par la méthode de Grinstead.81
IR (KBr) : 3060 (νC-H aromatique), 2960-2910 (νas CH3), 2860 (νs CH3), 1665 (νC=O), 1590, 1480, (νC-Caromatique), 1270-1240 (δCH3), 900 (γC-H aromatique, γC-C), cm-1.
Point de fusion 112-114°C.
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Références bibliographiques
94 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
[1] W. Kaim, J. Rall, Angew. Chem. Ed. Engl. 1996, 35, 43.
[2] N. Kitajima, Y. Moro-oka, Chem.Rev. 1994, 94, 737.
[3] F.H. Westheimer, Science, 1987, 235, 1173.
[4] Sreedhara, J.A. Cowan, J. Biol. Inorg. Chem. 2001, 6, 337.
[5] D.E. Wilcox, Chem.Rev. 1996, 96, 2435.
[6] L. S. Beese, T. A. Steitz, EMBO J. 1991, 10, 25.
[7] A. Volbadea, A. Lahm, F. Sakiyama, D. Suck, EMBO J. 1991, 10, 1607.
[8] J. F. Davies, Z. Hostomska, D. Hostomsky, S. R. Jordan, D. A. Matthews, Science, 1991, 252, 88.
[9] F.A. Cotton, E.E. Hazen Jr., M.J. Legg, Proc. Natl. Acad. Sci. 1979, 76, 2555. b) D.J.
Weber, A.K. Meeker, A.S. Mildvan, Biochemistry, 1991, 30, 6103. c) E.H. Serpersu, D.
Shortle, A.S. Mildvan, Biochemistry, 1987, 26, 1289.
[10] D. Kostrewa, F. K. Winkler, Biochemistry, 1995, 34, 638.
[11] E. Hough, L. K. Hansen, B. Birkness, K. Jynge, S. Hansen, A. Hordvik, C. Little, E.
Dodson, Z. Derewenda, Nature, 1989, 338, 357.
[12] T. Klabunde, N. Sträter, R. Fröhlich, H. Witzel, B. Krebs, J. Mol. Biol. 1996, 259, 737.
[13] E. E. Kim, H. W. Wyckoff, J. Mol. Biol. 1991, 218, 449.
[14] a) Y. Zhang, J.-Y. Liang, S. Huang, H. Ke, W. N. Lipscomb, Biochemistry, 1993, 32, 1844. b) J. Chin, Curr. Opin. Chem. Biol. 1997, 1, 514.
[15] a) J.H. Goldberg, Y. Huang, P. Kwon, A.C. Greengard, J. Nairna, J. Kuriyan, Nature, 1995, 376, 745. b) Y. Chu, E.Y. Lee, K.K. Schlender, J. Biol. Chem. 1996, 271, 2574.
[16] N. H. Williams, B. Takasaki, M. Wall, J. Chin, Acc. Chem. Res. 1999, 32, 485.
[17] R. Krämer, Coord. Chem. Rev. 1999, 182, 243.
Références bibliographiques [18] K. Katanayagi, M. Ishikawa, M. Okumura, M. Ariyoshi, S. Kanaya, Y. Kawano, M.
Suzuki, I. Tanaka, K. Morikawa, J. Biol. Chem. 1993, 268, 22092., b) H.-W. Huang, J. A.
Cowan, Eur. J. Biochem. 1994, 219, 253.
[19] D. L. Ollis, P. Brick, R. Hamlin, N. G. Xuong, T. A. Steitz, Nature, 1985, 313, 762.
[20] G.P. Mullen, E.H. Serpersu, L.J. Ferrin, L.A. Loeb, A.S. Mildvan, J. Biol. Chem.
1990, 265, 14327.
[21] I.B. Vipond, G.S. Baldwin, S.E. Halford, Biochemistry, 1995, 34, 697.
[22] T.A. Steitz, J.A. Steitz, Proc. Natl. Acad. Sci. 1993, 90, 6498.
[23] N. Sträter, T. Klabunde, P. Tucker, H. Witzel, B. Krebs, Science, 1995, 268, 1489.
[24] J. E. Coleman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1992, 21, 441.
[25] M. Komiyama, J. Biochem. 1995, 118, 665.
[26] E.L. Hegg, J.N. Burstyn, Coord. Chem. Rev. 1998, 173, 133.
[27] a) C. Duboc-Toia, S. Menage, J.M. Vincent, M.T. Averbuch-Pouchot, M. Fontecave, Inorg. Chem. 1997, 36, 6148., b) S. Albedyhl, M.T. Averbuch-Pouchot, C. Belle, B. Krebs, J. L. Pierre, E. Saint-Aman, S. Torelli, Eur. J. Inorg. Chem. 2001, 1457.
[28] F.M. Menger, M. Ladika, J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3145.
[29] K. A. Deal, J. N. Burstyn, Inorg. Chem. 1996, 35, 2792.
[30] a) S. Liu, A. D. Hamilton, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997, 7, 1779. b) J.K. Baskin, L.A. Jenkins, J. Chem. Soc. Dalton Trans. 1993, 3631. c) P.E. Jurek, A.E. Martell, Inorg.
Chem. 1999, 38, 6003.
[31] M. J. Young, D. Wahnon, R. C. Hynes, J. Chin, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 9441.
[32] M. Wall, R. C. Hynes, J. Chin, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1993, 32, 1633.
[33] P. Molenveld, J. F. J. Engbersen, H. Kooijman, A. L. Spek, D. N. Reinhoudt, J. Am.
Références bibliographiques
96
[34] M. J. Young, J. Chin, J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 10577.
[35] L. M. Rossi, A. Neves, R. Hörner, H. Terenzi, B. Szpoganicz, J. Sugai, Inorg. Chim.
Acta, 2002, 337, 366.
[36] C. Gerdemann, C. Eicken, B. Krebs, Acc. Chem. Res. 2002, 35, 183.
[37] A. L. Hughes, Immunogenetics 1999, 49, 106.
[38] J. R. Walker, P. H. Ferrar, Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 1998, 15, 457.
[39] C. Eicken, B. Krebs, J. C. Sacchettini, Curr. Opin. Struct. Biol. 1999, 9, 677.
[40] A. M. Mayer, E. Harel, Phytochemistry 1979, 18, 193.
[41] H. Hyodo, I. Uritani, Arch. Biochem. Biophys. 1967, 122, 299.
[42] C. Eicken, F. Zippel, K. Büldt-Karentzopolus, B. Krebs, FEBS Lett. 1998, 436, 293.
[43] T. Klabunde, C. Eicken, J.C. Sacchettini, B. Krebs, Nat. Struct. Biol. 1998, 5, 1084.
[44] C. Eicken, B. Krebs, J. C. Sacchettini, Curr. Opin. Struct. Biol. 1999, 9, 677.
[45] M. E. Cuff, K. I. Miller, K. E. van Holde, W. A. Hendrickson, J. Mol. Biol. 1998, 278, 855.
[46] E. I. Solomon, U. M. Sundaram, T.E. Machonkin, Chem. Rev. 1996, 96, 2563.
[47] H. Decker, F. Tuczek, Trends Biochem. Sci. 2000, 25, 392.
[48] G. Speier, J. Mol. Catal. 1986, 37, 259., J. Kaizer, J. Pap, G. Speier, L. Párkányi, L.
Korecz, A. Rockenbauer, J. Inorg. Biochem. 2002, 91, 190., M. R. Malachowski, B.
Dorsay, J. G. Sackett, R. S. Kelly, A. L. Ferko, R. N. Hardin, Inorg. Chim. Acta, 1996, 249, 85., M. R. Malachowski, J. Carden, M. G. Davidson, W. L. Driessen, J. Reedjik, Inorg. Chim. Acta, 1997, 257, 59., J. Manzur, A. M. Garcia, V. Rivas, A. M. Atria, J.
Valenzuela, E. Spodine, Polyhedron, 1997, 16, 2299.
[49] N. Oishi, Y. Nishida, K. Ida, S. Kida, Bull. Chem. Soc. Jpn. 1980, 53, 2847.
Références bibliographiques
[50] P. Gentschev, N. Möller, B. Krebs, Inorg. Chim. Acta, 2000, 442, 300.
[51] J. Reim, B. Krebs, J. Chem. Soc. Dalton Trans., 1997, 3793.
[52] A. Neves, L. M. Rossi, A. J. Bortoluzzi, B. Szpoganicz, C. Wiezbicki, E. Schwingel, W. Haase, S. Ostrovsky, Inorg. Chem. 2002, 41, 1788.
[53] S. Torelli, C. Belle, I. Gautier-Luneau, J.L. Pierre, E. Saint-Aman, J. M. Latour, L. Le Pape, D. Luneau, Inorg. Chem. 2000, 39, 3526.
[54] J. Ackerman, F. Meyer, E. Kaifer, H. Pritzkow, Chem. Eur. J. 2002, 8, 247.
[55] J. Mukherjee, R. Mukherjee, Inorg. Chim. Acta, 2002, 337, 429.
[56] E. Monzani, L. Casella, G. Zoppellaro, M. Gullotti, R. Pagliarin, R. P. Bonomo, G.
Tabbi, G. Nardin, L. Randaccio, Inorg. Chim. Acta, 1998, 282, 180.
[57] A.W. Addison, H.M.J. Hendriks, J. Reedijk, L.K. Thomson, Inorg. Chem. 1981, 20, 103.
[58] B.J. Hathaway in Comprehensive Coordination Chemistry, The Synthesis, Reactions, Properties and Applications of Coordination Compounds, eds. G. Wilkinson, R.D. Gillard, J.A. MacCleverty, Pergamon Press, Oxford, 5, 1987, 533.
[59] A.B.P. Lever, E. Milaeva, G. Speier in Pththalocyanines, Principles and Applications, eds. A.B.P. Lever, C.C. Leznoff, VCH Publishers Inc., New York, 1993, 3, 1.
[60] K.D. Karlin, J. Shi, J.C. Hayes, J.W. McKown, J.P. Hutchinson, J. Zubieta, Inorg.
Chim. Acta, 1984, 91, L3.
[61] K.D. Karlin, I. Sanyal, A. Farooq, R.R. Jacobson, S.N. Shaikh, J. Zubieta, Inorg.
Chim. Acta, 1990, 174, 13.
[62] M. Duggan, J. Chem. Soc. Dalton Trans., 1980, 1342.
[63] J.J. Maloney, M. Glogowski, D.F. Rohrbach, F.L. Urbach, Inorg. Chim. Acta, 1987,
Références bibliographiques
98
[64] R. A. Copeland, Enzymes: a practical introduction to structure, mechanism, and data analysis, 2nd ed., Wiley-VCH., 2000.
[65] E. Anslyn, R. Breslow, J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 4473.
[66] E. L. Hegg, J. N. Burstyn, Inorg. Chem., 1996, 7474.
[67] A. I. Vogel, A textbook of quantitative inorganic analysis, 3rd ed., Wiley:New York, 1961, 343.
[68] K. Schwetlick, Kinetische Methoden zur Untersuchung von Reaktionsmechanismen, VEB Deutscher Verlag der Wissenschaften, Berlin, 1978.
[69] G. Peintler, ZITA, A Comprehensive Program Package for Fitting Parameters of Chemical Reaction Mechanisms, Version 2.1-5.0, Department of Physical Chemistry, SZTE, Szeged, Hungary, 1989-2001.
[70] A. C. Hindmarsh, Gear: Ordinary Differential Equation System Solver. UCID-30001 rev. 3, Lawrence Livermore Laboratory, 1972.
[71] G. D. Byren, A. C. Hindmarsh, Stiff ODE Solvers: A Review of Current and Coming Attractions. Journal of Computation Physics, 1987, 70, 1.
[72] D. M. Himmelblau, Applied Nonlinear Programming. McGraw-Hill, New York, 1972.
[73] Y. Bard, Nonlinear Parameter Estimation. Academic Press, New York, 1974.
[74] G. Gran, Acta Chem. Scand., 1950, 4, 559.
[75] H.M. Irving, M.G. Miles and L.D. Pettit, Anal. Chim. Acta., 1967, 38, 475.
[76] L. Zékány, I. Nagypál, in: D.L. Leggett (Ed.), Computational Methods for the Determination of Stability Constants, Plenum Press, New York, 1985, 291.
[77] P. Gans, A. Sabatini and A. Vacca, J. Chem. Soc. Dalton Trans., 1985, 1195 [78] Brown, Usher, J. Chem. Soc. 1965, 6558.
Références bibliographiques
[79] C.B. Kretschmer, J. Nowakowska, R. Wiebe, Ind. Eng. Chem. 1946, 506.
[80] H. Schulze, W. Flaig, Justus Liebigs Ann. Chem. 1952, 231, 575.
[81] R. M. Grinstead, Biochem. 1964, 3, 1308.
[82] K. Selmeczi, M. Réglier, M. Giorgi, G. Speier, Coord. Chem. Rev., in press [83] K. Selmeczi, M. Réglier, G. Speier, G. Peintler, React. Kinet. Catal. Lett., in press
LISTES DES FIGURES ET TABLEAUX
Liste des Figures LISTE DES FIGURES
Figure 1. Mécanisme du clivage de la liaison en phosphodiester par l’ion hydroxide.
Figure 2. Activations différentes de phosphodiester catalysées par centre bimétallique.
Figure 3. Mécanisme proposé de la Staphylococcal nuclease.
Figure 4. Mécanisme proposé de L’endoribonucléase H d’E. coli.
Figure 5. Mécanisme proposé de l’ADN Polymerase I d’E. coli.
Figure 6. Mécanisme d’action de la PAP lors de l’hydrolyse d’un phosphomonoester.
Figure 7. Modes d’activation des phosphodiesters catalysés par les centres bicuivriques.
Figure 8. Mécanisme d’action de Tyr et CO.
Figure. 9 Structure de l’ibCO obtenue par diffraction des rayons X.
Figure 10. La sphère de coordination de centre actif binucléaire à cuivre de met-ibCO.
Figure 11. Superposition du site actif de l’ibCO en absence et présence de la PTU.
Figure 12. Mécanisme proposé par Solomon et al. en incluant les résultats plus récents concernant l’activité crésolase et catécholase de Tyr et/ou CO.
Figure 13. Synthèse des ligands L1-3.
Figure 14. Structure du complexe C1.
Figure 15. Titration photométrique du complexe C1 à 40°C.
Figure 16. Titration potentiométrique à 40°C du ligand L1 par KOH en absence (a) ou en présence (b) de 1 eq. de Cu(CF3SO3)2.
Figure 17. Concentrations relatives des composants équilibrés du complexe C1 en fonction du pH à 40°C.
Figure 18. Fraction du spectre UV-vis du complexe C1 dans 0.2 M KCl à pH 4.5 (a), dans 0.2 M KCl à pH 7.5 (b) et dans CH2Cl2 (c).
Figure 19. Structures proposées pour le complexe C1 en fonction du pH.
Liste des Figures
101 Figure 21. Structure du complexe C2.
Figure 22. Structure du complexe C3.
Figure 23. Titration photométrique à 40°C du complexe C3 en fonction du pH aux différentes absorbances.
Figure 24. Fraction du spectre UV-vis du complexe C3 pour une concentration de 2.5 mM dans KCl(0.2 M) entre les pH 3.5 et 6.5.
Figure 25. Fraction de spectre UV-vis du complexe C3 pour une concentration de 2.5 mM dans KCl (0.2 M) entre les pH 2.5 et 4.0.
Figure 26. Titration potentiométrique à 40°C du ligand L3 par KOH en absence (a) ou en présence (b) de 2 eq. de Cu(CF3SO3)2.
Figure 27. Structures proposées pour le complexe C3 en fonction du pH.
Figure 28. Concentrations relatives des composants du complexe C3 en équilibre en fonction du pH et à 40°C.
Figure 29. Substrats utilisés dans l’étude d’activité phosphatase des complexes C1 et C3.
Figure 30. Transestérification du HPNP par C1 à pH 6.0.
Figure 31. Dépendance de kobs vs. pH pour la transestérification du HPNP et l’hydrolyse du BNPP à 40°C.
Figure 32. Courbe de cinétique de saturation de la transestérification du HPNP par le complexe C1 à pH 7.0.
Figure 33. Transestérification du HPNP par le complexe C3 à pH 6.0.
Figure 34. Dépendance de pH vs. kobs pour la transestérification du HPNP et l’hydrolyse du BNPP à 40 °C.
Figure 35. Courbe de cinétique de saturation de la transestérification du HPNP par le complexe C3 à pH 6.0.
Figure 36. Mécanisme proposé pour l’hydrolyse du BNPP catalysée par le complexe
Liste des Figures
mononucléaire C1.
Figure 37. Structure du complexe [Cu2L3(CF3SO3)2] – BNPP.
Figure 38. Mécanisme proposé pour l’hydrolyse du BNPP (A, B) et transestérification de HPNP (C) catalysées par le complexe binucléaire C3.
Figure 39. Clivage de l’ADN 17pSAL4 (100 ng/µl) par les complexes C1 et C3 pendant 2h en milieu aqueux tamponné (pH 6.5, 10 mM HEPES).
Figure 40. Le changement de quantité totale d’ADN 17pSAL4 effectué par le complexe C3.
Figure 41. Évolution du spectre UV-vis de la formation du DTBQ enregistré à 0.5, 1.5, 2.5, 5, 7, 10, 15, 25, 60 min en MeOH.
Figure 42. L’oxydation du DTBCH2 par O2 en présence de C2 en fonction du temps.
Figure 43. L’absorbance mesuré du DTBQ au cours de la réaction selon la [DTBCH2]i
(a), la vitesse initiale de l’oxydation du DTBCH2 en fonction de la [DTBCH2]i (b).
Figure 44. La vitesse initiale de l’oxydation du DTBCH2 catalysée par C2 en fonction de la [O2].
Figure 45. Les diagrammes d’Arrhenius et d’Eyring de l’oxydation du DTBCH2 catalysée par C2
Figure 46. Mécanisme proposé de l’oxydation du DTBCH2 par O2 en présence de complexes binucléaires.
Figure 47. L’absorbance mesurée (points) et calculée (ligne continue) du DTBQ au cours de la réaction selon la [DTBCH2].
Figure 48. L’absorbance mesuré (points) et calculé (ligne continue) du DTBQ au cours de la réaction selon la [C2].
Figure 49. Les concentrations calculées des complexes 3 et 5 au cours de la réaction.
Figure 50. L’oxydation du DTBCH2 catalysée par C3 en fonction du temps.
Liste des Figures
103
Figure 51. L’absorbance mesurée du DTBQ au cours de la réaction selon la [DTBCH2]i
(a), la vitesse initiale de l’oxydation du DTBCH2 en fonction de la [DTBCH2]i (b).
Figure 52. La courbe Lineweaver-Burk de l’oxydation de DTBCH2 par O2 en présence C3.
Figure 53. La vitesse initiale de l’oxydation du DTBCH2 catalysée par le complexe C3 en fonction de [O2].
Figure 54. Les diagrammes d’Arrhenius et d’Eyring de l’oxydation du DTBCH2 catalysée par C3
Figure 55. L’absorbance mesurée (points) et calculée (ligne continue) du DTBQ au cours de la réaction selon la [DTBCH2].
Figure 56. L’absorbance mesurée (points) et calculée (ligne continue) du DTBQ au cours de la réaction selon la [C3].
Liste des Tableaux LISTE DES TABLEAUX
Tableau 1. Les fonctions des quelques cuproprotéines.
Tableau 2. Propriétés principales des centres métalliques de cuproprotéines.
Tableau 3. Exemples des enzymes hydrolases en représentant les caractéristiques de leur site active.
Tableau 4. Activité des complexes mono- et binucléaire à cuivre(II) lors de l’hydrolyse des phosphodiesters.
Tableau 5. Activité des complexes binucléaire à cuivre(II) lors de l’oxydation de DTBCH2
par O2.
Tableau 6. Principales distances (Å) et angles (°) autour de cuivre dans le complexe C1.
Tableau 7. Principales distances (Å) et angles (°)autour de cuivre dans le complexe C2.
Tableau 8. Principales distances (Å) et angles (°)autour des cuivres dans le complexe C3.
Tableau 9. Les absorbances caractéristiques des différents complexes cuivriques dans H2O.
Tableau 10. Données de la transestérification du HPNP (*1.85 mM) accéléré par le C1 à 40°C.
Tableau 11. Données de l’hydrolyse du BNPP (*1.92 mM) accéléré par le C1 à 40°C.
Tableau 12. Données calculées des courbes de saturation pour le C1 à pH 7.0.
Tableau 13. Données cinétiques de la transestérification du HPNP (*1.85 mM) catalysée par le complexe C3 à 40°C.
Tableau 14. Données cinétiques de l’hydrolyse du BNPP (*1.92 mM) catalysée par le complexe C3 à 40°C.
Tableau 15. Données calculées des courbes de saturation le C3 à pH 6.0.
Tableau 16. Accélération relative de vitesse de la réaction et la période de demi-vie des substrats en fonction du pH à 40°C.
Liste des Tableaux
105
Tableau 17. La différence entre les énergies libres des états de transition en cas des différents substrats.
Tableau 18. Principales distances (Å) et angles (°) autour des cuivres dans le complexe C3-BNPP.
Tableau 19. Clivage de l’ADN 17pSAL4 par le complexe C1.
Tableau 20. Clivage de l’ADN 17pSAL4 par le complexe C3.
Tableau 20. Les données cinétiques de l’oxydation du DTBCH2 par O2 en présence de C2.
Tableau 21. Les données cinétiques de l’oxydation du DTBCH2 catalysée par C3.
ANNEXES
Annexe – Composé C1
106
Composé C1 Formule C18H21CuF6N3O7S2
Masse moléculaire 633.02 Système cristallin monoclinique Group d’espace P21
a/ Å 8.4860(4) b/ Å 14.9830(4) c/ Å 10.0590(4) β/° 106.4101(10)
V/ Å3 1226.86(8)
Z 2 Densité calc./gcm-3 1.714
Couleur du cristal bleu µ(Mo-Kα)/cm-1 1.151 Mode de mesures Φ scan Nbr. Réfl. affinement 2551 Nbr. Paramètres affinés 333
R 0.0413 Rw 0.1168 S 1.105
∆ρ max/e.Å3 0.449
∆ρ min/e.Å3 -0.730
Annexe – Composé C1
Coordonnées des atomes
Atome X Y Z Cu1 0.03901(6) 0.1340 0.39763(4) S1 0.19677(15) 0.04522(9) 0.19143(12) S2 0.49939(18) 0.42604(12) 0.32353(15) F1 0.0183(5) 0.1470(4) -0.0087(4) F2 0.2741(7) 0.1698(4) 0.0401(6) F3 0.1694(8) 0.0523(4) -0.0716(4) F4 0.3562(13) 0.4031(10) 0.0637(7) F5 0.5150(16) 0.5143(13) 0.1097(12) F6 0.2853(10) 0.5213(7) 0.1498(8) O1 0.2125(4) 0.1166(2) 0.2946(4) O2 0.0510(7) -0.0069(4) 0.1709(6) O3 0.3479(6) -0.0003(3) 0.2028(5) O4 0.6327(9) 0.3717(5) 0.3128(9) O5 0.3648(9) 0.3818(5) 0.3482(8) O6 0.5481(8) 0.5042(5) 0.4071(7) O19 0.1210(6) 0.0220(3) 0.4961(5) N1 -0.1560(5) 0.1165(3) 0.4765(4) N2 0.1737(5) 0.2273(3) 0.5537(4) N3 -0.0757(5) 0.2181(3) 0.2503(4) C1 -0.1487(9) 0.0191(4) 0.5080(8) C2 0.0252(10) -0.0100(4) 0.5788(7) C3 -0.1394(8) 0.1677(4) 0.6080(6) C4 -0.0845(7) 0.2639(4) 0.6012(7) C5 0.0990(7) 0.2749(3) 0.6305(5) C6 0.1858(8) 0.3319(4) 0.7348(6) C7 0.3532(8) 0.3421(4) 0.7542(6) C8 0.4304(7) 0.2935(5) 0.6750(6) C9 0.3363(7) 0.2366(5) 0.5765(6) C10 -0.3175(6) 0.1380(5) 0.3733(6) C11 -0.3128(7) 0.1230(5) 0.2229(6) C12 -0.2312(6) 0.1997(3) 0.1734(5) C13 -0.3033(7) 0.2485(5) 0.0587(6) C14 -0.2216(9) 0.3203(4) 0.0198(7) C15 -0.0637(8) 0.3384(4) 0.1009(6) C16 0.0050(6) 0.2862(3) 0.2140(5) C17 0.1629(8) 0.1063(4) 0.0299(6) C18 0.4147(12) 0.4708(13) 0.1551(9)
Annexe – Composé C1
Annexe – Composé C1
Angles de liaison (degrés)
Atom.1 Atom.2 Atom.3 Angle(°) Atom.1 Atom.2 Atom.3 Angle(°)
Annexe – Composé C2
110
Composé C2 Formule C35H46Cu2F12N6O12S4
Masse moléculaire 1290.10 Système cristallin monoclinique Group d’espace P21/m
a/ Å 7.9636(3)
b/ Å 28.442(1)
c/ Å 11.7137(7)
β/° 103.850(3)
V/ Å3 2576.2(2)
Z 2 Densité calc./gcm-3 1.581
Couleur/taille (mm) du cristal Bleu/0.4×0.2×0.2 µ(Mo-Kα)/cm-1 1.090
Mode de mesures Φ scan Nbr. Réfl. affinement 4840 Nbr. Paramètres affinés 368
R 0.0869 Rw 0.2344 S 1.045
∆ρ max/e.Å3 1.137
∆ρ min/e.Å3 -0.940
Annexe – Composé C2
Annexe – Composé C2
112
Distances interatomique (Å)
Atome1 Atome2 Distance Atome1 Atome2 Distance Cu1 N3 1.984(5) F6 C19 1.30(2)
Cu1 N1 1.993(5) F6 C20 1.441(19)
Cu1 N2 2.023(4) F7 C19 1.33(2)
Cu1 O10 2.076(4) F7 C20 1.333(18)
Cu1 O3 2.226(4) F8 O11 1.26(2)
S1 O2 1.350(11) F8 C19 1.32(3)
S1 O2 1.351(11) O7 C20 1.68(3)
S1 O1 1.484(14) O11 C19 1.79(3)
S1 O4 1.55(3) N1 C7 1.348(9)
S1 C17 1.776(16) N1 C3 1.354(7)
S2 O6 1.425(7) N2 C15 1.473(6)
S2 O5 1.436(5) N2 C1 1.491(8)
S2 O5 1.436(5) N2 C8 1.503(8)
S2 C18 1.790(10) N3 C10 1.340(8)
S3 S4 0.727(7) N3 C14 1.371(8)
S3 O8 1.299(8) C1 C2 1.489(11)
S3 O9 1.413(7) C2 C3 1.479(10)
S3 O11 1.442(16) C3 C4 1.392(11)
S3 C19 1.79(2) C4 C5 1.354(14)
S3 C20 1.872(18) C5 C6 1.354(14)
S3 O7 2.08(2) C6 C7 1.371(11)
S4 O7 1.37(2) C8 C9 1.488(11)
S4 O9 1.432(9) C9 C10 1.506(10)
S4 O8 1.466(10) C10 C11 1.370(11)
S4 C20 1.473(19) C11 C12 1.349(13)
S4 C19 1.83(2) C12 C13 1.382(14)
S4 F5 1.855(13) C13 C14 1.361(11)
S4 O11 2.087(17) C15 C16 1.535(6)
F1 C17 1.232(15) C16 C15 1.535(6)
F2 C17 1.30(2) C17 F1 1.232(15)
F3 C18 1.339(12) C18 F4 1.289(7)
F4 C18 1.289(7) C19 C20 1.08(3)
F5 O7 0.97(2) F5 C20 1.267(19)
Annexe – Composé C2
Angles de liaison (degrés)
Atom.1 Atom.2 Atom.3 Angle(°) Atom.1 Atom.2 Atom.3 Angle(°)
Annexe – Composé C2
Annexe – Composé C3
Composé C3 Formule C34H37Cu2F9N6O10S3
Masse moléculaire 1083.08 Système cristallin orthorhombique Group d’espace pnma
a/ Å 16.9950(2) b/ Å 23.2200(2) c/ Å 11.0680(4)
V/ Å3 4367.7(2)
Z 4 Densité calc./gcm-3 1.815
Couleur/taille (mm) du cristal vert/0.4×0.4×0.2 µ(Mo-Kα)/cm-1 1.5
Mode de mesures Φ scan Nbr. Réfl. affinement 6800 Nbr. Paramètres affinés 349
R 0.0682 Rw 0.1691 S 1.042
∆ρ max/e.Å3 0.608
∆ρ min/e.Å3 -0.961
Annexe – Composé C3
Annexe – Composé C3
Annexe – Composé C3
118
Angles de liaison (degrés)
Atom.1Atom.2 Atom.3 Angle(°) Atom.1 Atom.2 Atom.3 Angle(°) O1 Cu1 N2 159.45(14) F2 C17 F1 92.3(9)
Annexe – Composé C3-BNPP
Composé C3-BNPP Formule C45H45Cu2F6N8O15PS2
Masse moléculaire 1482.106 Système cristallin Triclinique Group d’espace P -1 a/ Å 10.3462(3) b/ Å 14.0513(6) c/ Å 20.1235(9)
α/° 94.287(1)
β/° 102.043(2)
γ/° 107.853(2)
V/ Å3 2692.9(2)
Z 2 Densité calc./gcm-3 1.828
Couleur du cristal Bleu µ(Mo-Kα)/cm-1 1.35 Mode de mesures Φ scan Nbr. Réfl. affinement 7827 Nbr. Paramètres affinés 712
R 0.043 Rw 0.054 S
∆ρ max/e.Å3 0.56
∆ρ min/e.Å3 -0.29
Annexe – Composé C3-BNPP
120
Coordonnées des atomes
Atome X Y Z
Cu1 0.215195(6) 0.366424(4) 0.253540(3) Cu2 -0.086772(6) 0.174743(5) 0.293549(3) S1 0.667250(17) 0.727090(13) 0.062429(9) S2 0.416625(17) 0.249601(11) 0.481874(7) P1 0.079805(13) 0.133984(9) 0.188304(6) F1 0.42048(5) 0.58822(4) 0.02869(2) F2 0.41731(5) 0.73737(5) 0.04842(3) F3 0.47549(5) 0.66202(3) 0.13027(2) F4 0.33505(6) 0.06181(3) 0.50094(2) F5 0.53491(6) 0.11121(4) 0.47659(3) F6 0.51765(5) 0.15877(4) 0.57693(2) O1 0.07177(3) 0.30210(2) 0.302846(15) O2 0.17507(3) 0.08184(2) 0.233822(17) O3 0.17035(3) 0.23946(2) 0.189875(16) O4 -0.05499(3) 0.11820(2) 0.208016(15) O5 0.05080(3) 0.07056(2) 0.114525(16) O6 -0.25671(7) 0.17172(5) -0.15880(3) O7 -0.42768(8) 0.05870(5) -0.13557(4) O8 0.08094(6) -0.27957(4) 0.39944(3) O9 -0.06030(6) -0.35403(4) 0.30372(3) O10 0.65495(5) 0.74367(5) -0.00674(2) O11 0.72457(7) 0.65382(5) 0.08281(5) O12 0.72014(6) 0.81820(4) 0.10903(3) O13 0.35068(5) 0.21716(3) 0.41050(19) O14 0.33167(5) 0.27033(3) 0.52456(2) O15 0.55532(5) 0.32401(3) 0.49477(2) N1 0.28347(5) 0.48729(3) 0.33164(2) N2 0.39746(5) 0.41252(3) 0.22543(2) N3 0.10094(5) 0.43904(3) 0.17688(2) N4 -0.10011(5) 0.22748(3) 0.38930(2) N5 -0.27511(4) 0.20008(4) 0.23696(2) N6 -0.18324(4) 0.02977(3) 0.30390(2) N7 -0.30664(8) 0.11145(5) -0.12324(3) N8 0.02281(6) -0.27841(4) 0.34076(3) C1 0.07732(6) 0.37030(4) 0.36011(3) C2 0.22548(6) 0.44149(4) 0.38804(3) C3 0.43976(7) 0.53139(5) 0.35805(3) C4 0.51102(6) 0.45630(5) 0.34627(3) C5 0.52130(6) 0.44547(4) 0.27355(3) C6 0.64667(7) 0.47375(5) 0.25487(4) C7 0.64714(8) 0.47069(6) 0.18737(5) C8 0.52365(8) 0.43781(5) 0.13802(4) C9 0.39999(6) 0.40825(4) 0.15868(3) C10 0.22542(8) 0.57021(4) 0.31421(3) C11 0.23986(8) 0.60285(4) 0.24394(4) C12 0.12457(7) 0.53883(5) 0.18438(3) C13 0.04468(10) 0.58067(6) 0.13940(5)
Atome X Y Z
C14
-0.05970(10) 0.51892(8) 0.08499(5) C15 -0.08154(7) 0.41690(6) 0.07581(4) C16 0.00041(7) 0.38091(5) 0.12337(3) C17 0.03641(6) 0.31128(4) 0.41648(3) C18 -0.10995(7) 0.15182(5) 0.43834(3) C19 -0.04392(7) 0.07429(5) 0.42081(3) C20 -0.14373(6) -0.00504(4) 0.36295(3) C21 -0.20011(7) -0.10403(5) 0.37045(3) C22 -0.30365(8) -0.16945(5) 0.31741(4) C23 -0.34586(7) -0.13437(5) 0.25725(3) C24 -0.28292(6) -0.03489(5) 0.25236(3) C25 -0.21779(7) 0.26832(5) 0.38517(3) C26 -0.35807(7) 0.19686(5) 0.34229(3) C27 -0.38226(6) 0.19803(4) 0.26627(3) C28 -0.51041(6) 0.19444(5) 0.22704(4) C29 -0.53126(6) 0.19259(5) 0.15790(4) C30 -0.42327(7) 0.19617(5) 0.12762(3) C31 -0.29682(6) 0.20012(5) 0.16910(3) C32 -0.04083(5) 0.08517(3) 0.05720(2) C33 0.01391(6) 0.14978(4) 0.01494(3) C34 -0.07394(7) 0.15989(4) -0.04415(3) C35 -0.21218(7) 0.10448(4) -0.05867(3) C36 -0.26750(6) 0.03940(5) -0.01662(3) C37 -0.18040(6) 0.02900(4) 0.04281(3) C38 0.12999(5) -0.01029(4) 0.25773(3) C39 0.20888(6) -0.01580(4) 0.32079(3) C40 0.17467(6) -0.10402(4) 0.34804(3) C41 0.06168(6) -0.18504(4) 0.31101(3) C42 -0.01670(5) -0.18003(4) 0.24794(3) C43 0.01661(5) -0.09101(4) 0.22122(3) C44 0.48813(7) 0.67595(5) 0.06822(4) C45 0.45529(9) 0.14165(6) 0.51047(4)
Annexe – Composé C3-BNPP
Annexe – Composé C3-BNPP
Annexe – Composé C3-BNPP
Angles de liaison (degrés)
Atome 1 Atome 2 Atome 3 Angle(°)
Annexe – Composé C3-BNPP
Annexe – Composé C3-BNPP
Atome 1 Atome 2 Atome 3 Angle(°)
C5 C9 C8 91.19(4) C7 C9 C8 30.64(4) N1 C10 C11 114.05(5) C10 C11 C12 114.10(5) N3 C12 C11 117.23(6) N3 C12 C13 121.14(7) N3 C12 C14 90.99(5) N3 C12 C16 30.92(3) C11 C12 C13 121.63(6) C11 C12 C14 151.79(5) C11 C12 C16 148.14(5) C13 C12 C14 30.15(4) C12 C13 C14 119.65(7) C12 C13 C15 89.49(5) C14 C13 C15 30.16(4) C12 C14 C13 30.20(4) C12 C14 C15 89.27(5) C12 C14 C16 57.97(3) C13 C14 C15 119.47(7) C13 C14 C16 88.16(5) C14 C15 C16 117.38(7) N3 C16 C12 30.95(3) C18 C19 C20 109.93(5) N6 C20 C19 115.15(5) N6 C20 C21 121.64(6) N6 C20 C22 91.18(4) N6 C20 C24 30.69(3) C19 C20 C21 123.00(5)
Atome 1 Atome 2 Atome 3 Angle(°)
C19 C20 C22 152.97(4) C19 C20 C24 145.52(4) C21 C20 C22 30.48(3) C20 C21 C22 119.35(6) C20 C21 C23 89.08(4) C22 C21 C23 30.28(3) C20 C22 C21 30.17(3) C20 C22 C23 89.26(4) C20 C22 C24 58.56(2) C21 C22 C23 119.41(6) C21 C22 C24 88.71(4) C22 C23 C24 118.39(6) N6 C24 C20 30.89(3) C25 C26 C27 115.30(5) N5 C27 C26 117.86(5) N5 C27 C28 120.88(6) N5 C27 C29 91.23(4) N5 C27 C31 30.79(3) C26 C27 C28 121.24(5) C26 C27 C29 150.86(4) C26 C27 C31 148.64(4) C28 C27 C29 29.65(4) C27 C28 C29 120.26(6) C27 C28 C30 89.92(4) C29 C28 C30 30.34(3) C27 C29 C28 30.09(3)
Annexe – Composé C3-BNPP
126
Atome 1 Atome 2 Atome 3 Angle(°) C27 C29 C30 89.47(4) C27 C29 C31 58.35(2) C28 C29 C30 119.56(5) C28 C29 C31 88.43(4) C29 C30 C31 118.00(6) N5 C31 C27 31.23(3) C33 C32 C37 122.26(5) C34 C32 C36 60.56(3) C32 C33 C34 119.20(5) C32 C33 C35 88.91(4) C33 C34 C35 118.82(5) C33 C34 C36 89.80(4) C34 C35 C36 122.22(5) C34 C35 C37 91.72(4) C35 C36 C37 119.39(5) O5 C37 C32 30.88(3) C32 C37 C36 118.12(5) C33 C37 C35 59.20(2) C39 C38 C43 121.95(5) C40 C38 C42 61.24(2) C38 C39 C40 119.33(5) C38 C39 C41 88.45(3) C40 C39 C41 30.89(3) C38 C40 C39 30.46(3)
Annexe – Composé C3-BNPP
Atome 1 Atome 2 Atome 3 Angle(°) C38 C40 C41 88.09(3) C39 C40 C41 118.54(5) O8 C41 O9 54.98(2) C40 C41 C42 122.29(5) C40 C41 C43 91.83(3) C42 C41 C43 30.47(3) C38 C42 C41 88.38(3) C38 C42 C43 30.65(3) C41 C42 C43 119.01(4) C38 C43 C41 88.34(3) C38 C43 C42 118.85(5) C41 C43 C42 30.52(3)
DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI
RÉZ(II) KOMPLEXEK, MINT FUNKCIONÁLIS ÉS SZERKEZETI ENZIMMODELLEK FOSZFORSAV ÉSZTEREK HIDROLÍZISÉBEN
VALAMINT PIROKATECHIN OXIDÁCIÓJÁBAN
Selmeczi Katalin
Témavezetők Dr. Speier Gábor Dr. Marius Réglier
Veszprémi Egyetem, Szerves Kémia Tanszék
Université d’Aix-Marseille III, Laboratoire de Bioinorganique Structurale
2003
I. ELŐZMÉNYEK, CÉLKITŰZÉSEK, BEVEZETÉS
A szervezetben folyó kémiai átalakulások számos lépésből összetevődő reakcióutak formájában valósulnak meg, általában minden egyes lépést más és más enzim katalizál. A metalloenzimek aktív centrumában egy vagy több fémion található melyek nélkülözhetetlenek az enzim működéséhez. Az utóbbi két évtizedben jelentős fejlődésnek indult az ún. bioutánzó kémia mely az enzimek mechanizmusának, az aktív centrum lényeges szerkezeti paramétereinek meghatározását vette célba. Ez a biológia és kémia határán működő tudományág kis molekulatömegű vegyületek segítségével az enzimek szerkezeti, spektroszkópiai tulajdonságait (szerkezeti modellek) valamint az aktív helyen, a fémion koordinációs övezetében lejátszódó folyamatokat (funkcionális modellek) próbálja felderíteni. Modellreakciók vizsgálata lehetővé teszi új katalizátorok kifejlesztését, lehetőséget nyújthat új szerves kémiai reakciók felismerésére és kidolgozására is.
A dolgozatban bemutatásra kerülő kutatómunka céljául metallofoszfoészterázok illetve pirokatechin oxidáz enzim hatásmechanizmusának, szerkezet és reakciókészség közötti összefüggés vizsgálatát tűztük ki egyszerű modellrendszereken keresztül.
A foszfoészterázok a foszfoészter kötés hidrolitikus hasításáért felelős enzimek.
Rendkívül jelentős és szerteágazó biológiai szereppel bírnak. A legtöbb biomolekulában a foszfoészter kötés kinetikai szempontból rendkívül inert, pl. a DNS félélettartama fiziológiás körülmények között kb. 200×106 év, RNS esetében ez néhány 100 évre tehető.
A metallofoszfoészterázok a DNS, RNS hidrolízisét mintegy 1016 faktorral is megnövelhetik. Az elmúlt tíz évben széleskörű kutatások indultak meg a foszfoészterázok funkcionális modellezésére, az ún. mesterséges nukleázok előállítására és gyakorlati alkalmazására.
A metallofoszfoészterázok részletes szerkezet vizsgálata megmutatta, hogy ezen enzimek aktív centrumában egy, két esetleg három fémion található, mely utóbbi két esetben a fémionok együttműködése hatékonyabb hidrolitikus aktivitást eredményez. Ennek megfelelően, a fémion szerepének feltérképezésére vizsgáltuk és összehasonlítottuk egy- illetőleg kétmagvú réz(II)komplexek foszforsav észter hidrolízisben mutatott aktivitását.
Modellvizsgálatok során ún. aktívált foszforsavésztereket alkalmaztunk, melyek reaktívabbak és hidrolízisük detektálása is egyszerűbb a természetes szubsztrátumokhoz viszonyítva. Így bisz(4-nitrofenil)-foszfátot (BNPP), mint DNS, 2-hidroxopropil-4-nitrofenil-foszfátot (HPNP), mint RNS modellvegyület átésztereződését tanulmányoztuk
130
A pirokatechin oxidáz növényekben, néhány rák- és rovarfélében megtalálható réztartalmú enzim, mely o-fenolok oxidációját katalizálja a megfelelő o-kinonná.
Édesburgonyából izolált enzim (Ipomoea batatas) met és deoxy formájának röntgenszerkezete már rendelkezésünkre áll, így ismert, hogy aktív centrumában két rézion található, melyek 3NHis koordinálódnak, az oxidált formában a két rézion egy hidroxo-hídon keresztül kapcsolódik össze. Az enzim hatásmechanizmusának pontosabb megismerésére valamint a szerkezet és a reakciókézség közötti összefüggés vizsgálatára két, kétmagvú réz(II)komplexet vizsgáltunk. Modellreakciókban 3,5-di-tert-butil pirokatechin (DTBCH2) oxidációját vizsgáltuk 3,5-di-tert-butil-1,2-benzokinonná (DTBQ) oxigén jelenlétében szobahőfokon és légköri nyomáson.
II. ALKALMAZOTT KÍSÉRLETI MÓDSZEREK
A kísérleti rész mind preparatív kémiai, mind kinetikai jellegű munkát is magába foglalt.
Az alkalmazott ligandumok, réz(II)-komplexeik illetve egy esetben a katalizátor-szubsztrátum komplex tisztítására, szerkezetük meghatározására számos elválasztási és szerkezet-felderítési fizikai-kémiai módszert (UV-vis, IR, 1H-, 13C NMR, ESR, mágneses szuszceptibilitás, RX, CV, elemanalízis) módszert alkalmaztunk. A kinetikai vizsgálatokat UV-vis spektroszkópiás, HPLC illetve gélelektroforézis kromatográfiás módszerek alkalmazásával végeztük.
III. ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK
A. FOSZFOÉSZTERÁZ ENZIM FUNKCIONÁLIS MODELLVEGYÜLETEK ELŐÁLLÍTÁSA ÉS VIZSGÁLATA
1. Előállítottuk az N,N-bisz(2-[2-piridil]etil)-etanol amin (L1OH) és az 1,3-bisz{N,N-bisz(2-[2-piridil]etil)}amino-2-hidroxipropán (L2OH) ligandumokat valamint Cu(CF3SO3)2-al képzett [Cu(L1O)](CF3SO3)](CF3SO3) (C1), [Cu2(L2O)](CF3SO3)](CF3SO3)2 (C2) komplexeiket, melyek szerkezeteit röntgendiffrakciós módszerrel is meghatároztuk. Megállapítottuk, hogy mindkét esetben a réz(II)ionok torzult tetraéderes környezetben foglalnak helyet.
2. Elvégeztük C1 és C2 komplexek oldategyensúlyi vizsgálatát vizes közegben potenciometrikus és fotometrikus titrálással. Megállapítottuk, hogy a C1 komplex esetén a vizsgált pH tartományban [CuL1]2+, [CuL1H-1]+ részecskék egyensúlya (pKa 6,1) a meghatározó. A [CuL1H-1]+ komplex szerkezetében a ligandum hidroxil csoportja deprotonálódik, a réz(II) körüli koordinációs övezet 3Npy, RO- és H2O koordinációjával irható le. A C3 komplex esetében már 3 részecske egyensúlyát kell figyelembe vennünk, azaz a [Cu2L2]4+, [Cu2L2H-1]3+ valamint a [Cu2L2H-2]2+ van jelen az oldatban (pKa1 3,7;
pKa2 6,1). A [Cu2L2H-1]3+ esetében egy-egy réz(II) ionhoz 3Npy, a ligandum deprotonálódott hidroxil csoportja valamint egy molekula víz koordinálódik. A [Cu2L2H -2]2+ komplexben egy koordinálódott H2O molekula deprotonálódik dihidroxo-hidas komplexet képezve.
3. A C1 komplex BNPP és HPNP hidrolízisében, pH 5,5-8,0 tartományban mutatott aktivitását összehasonlítva az oldategyensúlyi vizsgálat során kapott eredményekkel elmondhatjuk, hogy csak a [CuL1H-1]+ részecske mutat aktivitást. A részletes kinetikai vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy a hidrolízis a Michaelis-Menten kinetikát követi és javaslatot tettünk a reakció mechanizmusára (1). A C1 komplex esetén a szubsztrátum egyszeres Lewis savas aktiválásáról beszélhetünk.
N Cu2+ O
4. A C2 komplex esetén a hidrolízisben mutatott aktivitás és az oldategyensúlyi vizsgálatok eredményei alapján megállapítottuk, hogy a [Cu2L2H-1]3+ részecske rendelkezik hidrolitikus aktivitással a pH 5,5-8,0 tartományban, fiziológiás körülmények között.
A C2-BNPP komplex röntgenszerkezete és további hidrolízisben mutatott inaktivitása alapján megállapítottuk, hogy a reakció nem a szubsztrátum réz(II)ionokhoz történő kétszeres koordinációjával kapott komplexen keresztül megy végbe (kétszeres Lewis savas aktiválás).
A részletes kinetikai vizsgálatok alapján ebben az esetben is a reakció a Michaelis-Menten kinetikát követi, mely alapján javaslatot tettünk a hidrolízis reakció mechanizmusára. Két
132
protonálása, majd ezt követően a hidroxil csoport P-atomon történő nukleofil támadása következik be.
A C2-BNPP komplex röntgendiffrakciós módszerrel megállapított szerkezete.
(2)
A (3) reakció szerint a réz(II)ionhoz koordinálódott H2O molekula protonálja a foszforsav észtert majd az így kapott hidroxil csoport nukleofil támadása történik meg. Ebben az esetben a réz(II)ionhoz koordinálódott távozó csoport stabilizálásáról is beszélhetünk.
(3)
A C1 és C2 komplexek BNPP hidrolízisében és HPNP átészterezésében mutatott aktivitásaikat összehasonlítva megállapíthatjuk, hogy a kétmagvú C2 komplex 14-szer
N N
aktívabbnak bizonyult BNPP hidrolízisében, míg 21-szer aktívabbnak HPNP átészterezésében a megfelelő egymagvú C1 komplexhez viszonyítva. Elmondhatjuk, hogy a BNPP szubsztrátum igen stabilis, félélettartama 600 nap (40 °C, pH 6,0), C2 komplex (5×10-4 M) jelenlétében ez az érték 0,96 nap, tehát közel 600-szoros sebességnövekedésről beszélhetünk a szubsztrátum autohidrolíziséhez viszonyítva. HPNP esetén ez az érték 340.
Elmondható, hogy a kétmagvú C2 komplex esetén a két Cu(II)ionok közötti együttműködés (szubsztrátum és a koordinálódott H2O molekula Lewis savas aktiválása) jelentős mértékben megnövelte a hidrolízis reakció sebességét az egymagvú C1 komplexhez viszonyítva (szubsztrátum Lewis savas aktiválása).
5. Megvizsgáltuk C1 és C2 komplexek hidrolitikus aktivitását DNS hidrolízisében fiziológiás körülmények (40 °C, pH 6,5) között. Megállapítottuk, hogy mindkét komplex jelentős aktivitást mutat, az egymagvú C1 komplex specifikusan az egy- és kétszeresen hasított formát adja, míg a kétmagvú C2 komplex esetén a DNS hasítás nem specifikus.
B. PIROKATECHIN OXIDÁZ ENZIM SZERKEZETI ÉS FUNKCIONÁLIS MODELLVEGYÜLETEK ELŐÁLLÍTÁSA ÉS VIZSGÁLATA
B. PIROKATECHIN OXIDÁZ ENZIM SZERKEZETI ÉS FUNKCIONÁLIS MODELLVEGYÜLETEK ELŐÁLLÍTÁSA ÉS VIZSGÁLATA