Discussion

Dans cette partie, nous allons comparer l’efficacité en phosphoester hydrolysis des complexes mono- et binucléaire C1 et C3.

Les deux complexes présentent une sphère de coordination équivalente constituée de deux atomes d’azote pyridinique, d’une amine tertiaire, d’un groupement alkoxyde et d’une molécule d’eau.

Des études acido-basiques effectuées sur les complexes diaquas ont mis en évidence la présence de 3 espèces différentes dont les concentrations relatives dépendent du pH.

L’activité phosphatase des complexes C1 et C3 a été examinée en fonction du pH et a démontré que les complexes actifs possèdent un groupement d’alkoxyde et une molécule d’eau liée sur les atomes de cuivre. La présence de cette molécule d’eau labile est

Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3

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indispensable pour l’échange avec le groupement phosphodiester.

En comparant les kobs ou les périodes de demi-vie (t1/2=ln2/kobs) des substrats BNPP et HPNP obtenues pour les complexes C1 et C3, nous pouvons constater que le complexe mononucléaire C1 réagit ~14 fois moins vite pour le HPNP et 21 fois moins vite pour le BNPP que le complexe binucléaire à pH 6.0 et 40 °C (Tab. 16).

Nous pouvons aussi dire qu’en absence de complexes cuivriques, le HPNP est très stable (t1/2=134 jours) et qu’en présence de 5×10^-4 M complexe binucléaire C3 il se clive vite, t1/2 de 0.4 jour à pH 6.0. Cela correspond à ~340 fois d’accélération de vitesse par rapport à l’autohydrolyse du substrat. Dans cas du BNPP, cette valeur est ~600. Pour le complexe mononucléaire C1, ces valeurs sont d’un ordre de grandeur plus faibles à pH 6.0.

Tableau 16. Accélération relative de vitesse de la réaction et la période de demi-vie des substrats en fonction du pH à 40 °C.

En général, l’étape qui exige la plus grande énergie est l’accès à l’état de transition qui détermine la vitesse de la réaction. Par le quotient de kcat/KM, la différence entre les énergies libres des états de transition (∆∆Gcomplexe-substrat‡) peut être calculée à température constante (Eq. 5).⁶⁴

où les indices 1 et 2 se réfèrent à des substrats différents comparés pour un même complexe ou des complexes différents pour un même substrat. Avec cette analyse la contribution thermodynamique des composants structuraux particuliers au clivage peut être quantifier et l’efficacité des complexes comparer. La valeur positive ∆∆G^‡ indique que le clivage du (substrat)2 est plus rapide (Tab. 17).

Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3 Tableau 17. La différence entre les énergies libres des états de transition en cas des

différents substrats.

∆∆Gcomplexe-substrat‡ ∆∆Gcomplexe-substrat‡

BNPP/HPNP C1/C3

C3 970 Jmol^-1 BNPP 7950 Jmol^-1

C1 2720 Jmol^-1 HPNP 6200 Jmol^-1

La valeur faible de ∆∆G^‡ pour le complexe C3 indique que la coordination bidentate peut stabiliser l’état transition.

A partir de ces résultats nous pouvons conclure que la plus grande activité du complexe dinucléaire C3 par rapport au mononucléaire C1 réside dans l’effet synergique de deux atomes de cuivre.

Le clivage des phosphodiesters accéléré par le complexe mononucléaire se produit

1. par l’activation simple d’acide de Lewis (coordination monodentate au cuivre) en changant la molécule d’eau coordinée au cuivre(II),

2. suivi l’attaque du groupement hydroxyl sur le phosphore (Fig. 36).

Nous avons montré dans la Chapitre I. que Chin et coll. ont examiné la réactivité des complexes Cu-alkoxyde (modèles 5 a, b, c) et ils ont affirmé que selon la longueur de la chaîne d’alkoxyde l’hydrolyse ou transesterification peut se produire.³¹

Pour bien soutenir ce mécanisme proposé, nous avons effectué l’analyse d’HPLC en phase inverse (colonne C8, 1:1 MeOH/50 mM tampon phosphate, pH 7.0) pour identifier les produits et nous avons démontré que le complexe C1 n’accelère que l’hydrolyse de BNPP.

N Cu²⁺ O

Figure 36. Mécanisme proposé pour l’hydrolyse du BNPP catalysée par le complexe mononucléaire C1.

Dans le cas du complexe binucléaire C3, selon l’analyse de la propriété acido-basique, nous avons trouvé qu’il était le plus actif en forme diaquas [Cu2L³H-1(H2O)2]³⁺ à pH 6.0.

Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3

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Nous avons pu isoler en solution aqueuse et caractériser par diffraction des rayons X, le complexe de C3-BNPP représenté sur la Fig. 37. Dans ce complexe, les atomes de cuivre ont une géométrie pyramide à base carrée (τ=0.14 pour Cu1 et 0.26 pour Cu2). La base de la pyramide est définie par l’azote tertiaire, un des deux pyridines, l’oxygène de phosphoester et de ligand L³. L’autre pyridine occupe la position apicale pareillement à la structure de C3. La distance cuivre(II)-azote est plus long que dans le complexe C3, Cu1-N3 = 2.2432(4) Å et Cu2-N5 = 2.1864(4) Å. Les bases des pyramides construites par les atomes O1, O3, N1, N2 et O1, O4, N4, N6 sont planars, en incluant les atomes Cu1 et Cu2 les distances de hors de plan sont 0.25 Å et 0.27 Å, respectivement. La distance intermétallique est 3.7252(2) Å. Le noyau phényl de BNPP défini par les atomes C38, C39, C40, C41, C42 et C43 est en contact "π-stacking" avec la pyridine du ligand défini par les atomes N6, C20, C21, C22, C23 and C24. Les paramètres géométriques autour de cuivre sont présentés dans le Tab. 18.

L’activité phosphatase de ce composé C3-BNPP (pH 6.0, 50 mM MES, 40 °C) a été étudiée. Cette étude nous a démontré que le C3-BNPP restait inactif en hydrolyse de BNPP dans la condition de la réaction.

Figure 37. Structure du complexe [Cu2L³(CF3SO3)2] – BNPP.

Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3 Tableau 18. Principales distances (Å) et angles (°) autour des cuivres dans

le complexe C3-BNPP.

Distances (Å) Angles (°) Angles (°) Cu1 N1 2.0628(4) N1 Cu1 N3 95.47(2) N4 Cu2 N5 95.63(2) Cu1 N2 2.0116(4) N2 Cu1 N3 95.92(2) N6 Cu2 N5 95.93(2) Cu1 N3 2.2432(4) O1 Cu1 N3 102.66(14) O1 Cu2 N5 106.976(14) Cu1 O1 1.9823(3) O3 Cu1 N3 94.77(2) O4 Cu2 N5 91.56(2) Cu1 O3 1.9854(3) N2 Cu1 O3 86.35(15) N6 Cu2 O4 86.104(15) Cu2 N4 2.0595(4) N2 Cu1 N1 91.63(2) N6 Cu2 N4 91.93(2) Cu2 N5 2.1864(4) O1 Cu1 N1 86.28(2) O1 Cu2 N4 86.62(2) Cu2 N1 2.0230(4) O1 Cu1 O3 92.409(13) O1 Cu2 O4 92.451(12) Cu2 O1 1.9874(3) N1 Cu1 O3 169.72(2) N4 Cu2 O4 172.71(2) Cu2 O4 1.9733(3) O1 Cu1 N2 161.41(2) O1 Cu2 N6 157.079(15) Cu1 Cu2 3.725(3) Cu1 O1 Cu2 139.57(2) Cu1 O3 P1 132.63(2)

Nous supposons que le complexe C3-BNPP stabilisé par la double coordination de BNPP à deux cuivre(II), en absence d’agent réactif (pas de nucléophile OH^- coordiné au métal ou base générale à pH 5.5-6.0, Chapitre I. Fig. 2) reste inactif. Donc deux mécanismes ont été proposés selon lesquels la réaction se produit via la coordination monodentate du substrat par échange d’une molécule d’eau suivi la protonation du substrat par l’autre molécule d’eau coordinée au cuivre(II). Le nucléophile hydroxyde formé peut ensuite attaquer sur le P-atome en formant le phosphore pentacoordiné selon le mécanisme général. La protonation du substrat qui le stabilise et facilite l’attaque nucléophile peut se produire soit sur le groupement sortant (Fig. 38/a)¹⁶ soit sur l’atome O^- (Fig. 38/b). Dans ce dernier cas le groupement sortant est stabilisé par la coordination au métal. Baskin et coll. ont examiné l’hydrolyse de 2’,3’-cAMP en présence de composé modèle 4 où R=H.^30b Ils ont trouvé que le complexe aqua n’était actif qu’en hydrolyse de 2’,3’-cAMP, il n’a pas montré d’activité en hydrolyse de BNPP à pH 7. Selon le mécanisme proposé la réaction est catalysée par acide Brønsted-Lowry/base Brønsted-Lowry formée du complexe par analogie avec le clivage d’ARN catalysé par imidazolium/imidazol.⁶⁵

Le mécanisme proposé pour la transestérification de HPNP est représenté su la Fig. 38/c.

Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3

Figure 38. Mécanisme proposé pour l’hydrolyse du BNPP (A, B) et transestérification de HPNP (C) catalysées par le complexe binucléaire C3.

L’efficacité du complexe C1 est comparable à celles des modèles mononucléaires 4, 7 présenté dans la Chapitre I. (4: krelHPNP=51, 5: krelEPNP=82) mais très inférieure à celles obtenues par des modèles 2, 3 (krel > 10⁴). Pour le complexe C3, le modèle 10 montre des analogies mais les complexes 9, 11, 12 s’avèrent plus actifs avec un ordre de magnitude (krel ~ 10³). En comparant le synergisme comme le facteur le plus caractéristique, notre système est moins actifs par rapport aux pairs de modèles des 4-9, 6-11, 7-12.

N N

Chapitre III. – Activité phosphatase des complexes C1 et C3 Ce travail a montré que la simple activation d’acid Lewis du substrat par le métal n’est pas suffisant d’augmenter la vitesse du clivage. L’efficacité des modèles reside dans le rôle essentiel de l’hydroxide coordonné au cuivre(II). Nous avons aussi demontré que le dinucléarité du système est important car elle permet une synergie entre les deux atomes métalliques. Notre système C3 est capable d’hydrolyser le substrat en absence de nucléophile hydroxyle.