Spécifications des complexes modèles :
1. Comme nous l’avons montré, ils doivent être de fort acide de Lewis pour pouvoir déprotoner l’eau coordinée au métal à pH physiologique.
2. Ils doivent avoir au moins deux sites de coordination libres en position cis pour pouvoir assurer la coordination du substrat et de l’hydroxyde.
3. Ils doivent avoir une charge globale positive ou neutre pour pouvoir favoriser la coordination du phosphoester chargé négativement.
Dans le but de pouvoir comprendre le mécanisme d’action de ces enzymes et non seulement former des hydrolases artificielles efficaces, de nombreuses publications ont été publiées sur l’activité des modèles mono- et binucléaires.
Chapitre I. – Introduction bibliographique
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Par la suite, nous présenterons quelques complexes mono- et binucléaires du cuivre(II) en comparant les valeurs thermodynamiques et cinétiques comme pKa, kobs, krel, kcat/KM et k2 en considérant qu’il est difficile de trouver des conditions et paramètres identiques pour tous les cas présentés.
Le pKa signifie le pH où le premier proton de H2O coordinée au métal est libéré, kobs est la constante de vitesse en pseudo premier ordre, krel=kobs/knoncatalysé, kcat/KM est donné dans quelques cas où la réaction suit la cinétique Michaelis-Menten et k2 est la constante de vitesse en second ordre (kobs/[complexe]).
De nombreux complexes à Zn2+, Co3+, Ln3+ sont connus mais dans le cadre de cette dissertation nous ne consulterons que les complexes à cuivre(II).
Les kobs sont données pour le pH proches du pKa déterminé par titration potentiométrique démontrant le rôle déterminant de l’hydroxyde coordiné au cuivre(II) dans l’hydrolyse. Nous considérons que les ligands Cl-, NO3-, acetato, seront échangés dans la solution aqueuse.
Les complexes mononucléaires les plus souvent étudiés sont les modèles 1, 2, 4 via lesquels on peut bien présenter le rôle de l’hydroxyde. Selon le mécanisme proposé le substrat est coordiné au cuivre(II) par l’échange d’une molécule d’eau suivi soit l’attaque intramoléculaire de l’hydroxyde coordiné au métal sur le phosphore (hydrolyse) soit la deprotonation d’OH du substrat (transestérification) (Fig. 2/A, D). Pour le modèle 4, si R=H la réaction d’hydrolyse ou transestérification est très lente car on l’examine au dessous de pKa, par contre pour R=CH2N(CH3)2 l’amine tertiaire joue le rôle de base pour déprotoner l’hydroxyde du HPNP et accélérer la réaction. Si le pH>8.0 où la molécule d’eau coordinée est déjà deprotonée, la vitesse d’hydrolyse et transestérification catalysée par le complexe 4 où R=H augmente, kobs=6.8×10-7 s-1 et 3.5×10-5 s-1 respectivement.
Comme nous l’avons présenté pour les enzymes, le groupement organique de la chaîne peptidique joue un rôle important (Tab. 3). Dans le modèle 3, où deux chaînes de propyne avec des groupements d’ammonium (empêche la formation de chélate intramoléculaire) sont fixées sur la bpy (lieu de la coordination du cuivre(II)), on peut constater une augmentation appréciable de la vitesse par rapport au simple bpy (2).
Chin et coll. ont examiné les modèles 5a, b, c pour hydrolyse du BDNPP. Ils ont trouvé qu’à pH 8.8 et 25°C, 5c est 40 fois plus actif que le complexe 5a. Selon le mécanisme proposé pour 5c, le substrat s’échange avec la molécule d’eau et le nucléophile Cu-alkoxyde attaque le phosphodiester coordiné (transestérification). Il est intéressant que
Chapitre I. – Introduction bibliographique le 5c 100 fois plus actif que le 5b où l’hydrolyse s’effectue par l’hydroxyde coordiné au cuivre(II). Tout cela vient de la structure différente de l’intermédiaire car 5c peut former un chélate plus stable via le bras hydroxypropyle.
La compréhension véritable du mécanisme d’action des phosphoesterases peut être conduite via l’étude des complexes binucléaire à cuivre(II). Dans ces cas, la coopération entre les ions métalliques, la possibilité d’activation par double acide Lewis et que tous quelle façon influencent la vitesse de la réaction par rapport aux complexes mononucléaires peuvent être examinées. Les exemples présentés pour les complexes binucléaires peuvent être considérés comme les dimères des complexes mononucléaires correspondants (1-8, 4-9, 6-11, 7-12) et de cette manière l’activation soit par double acide Lewis (8, 9, 11, 12, Fig. 7/A) soit par simple activation d’acide Lewis et formation de l’hydroxyde nucléophile (10, Fig. 7/B) peuvent être mise en évidence. Le taux de synergisme entre les deux cuivre(II) peut être bien exprimer par la valeur de kobsbinucléaire/kobsmononucléaire (Tab. 4).
P RO
O
OR O Cu2+ Cu2+
P RO
-O
OR O Cu2+ OH
-A B
-Cu2+
OH
-Figure 7. Modes d’activation des phosphodiesters catalysés par les centres bicuivriques.
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Tableau 4. Activité des complexes mono- et binucléaire à cuivre(II) lors de l’hydrolyse des phosphodiesters.
Composés modèles Paramètres cinétiques COMPLEXES MONONUCLEAIRE
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20 9.
HPNP30a
kobs=2.93×10-4 s-1, k2=0.15M-1s-1 krel=2600, synergisme 51
pH 7.0, 25°C, H2O, [complexe]=2×10-3 M krel=2600, synergisme 53
pH 7.0, 25°C, H2O, [complexe]=1×10-3 M krel=10000, synergisme 22 KM=4.0×10-3 M, kcat=2.1×10-3 s-1
Chapitre I. – Introduction bibliographique I. 3 La Catéchol Oxydase
La Catéchol Oxydase (CO) est une cuproenzyme de type III (binucléaire couplée) qui catalyse l’oxydation des catéchols (o-diphénol) en o-quinones correspondantes en présence d’oxygène. La tyrosinase (Tyr), une autre cuproenzyme de type III, possède en plus de l’activité oxydase, une activité monooxygénase (activité crésolase) qui lui permet de transformer les phénols en o-diphénols (Fig. 8).36
OH 1/2 O2 1/2 O2 H2O
OH
OH
O
O Activité crésolase
(Tyrosinase)
Activité catécholase (Tyrosinase et Catéchol Oxidase)
Figure 8. Mécanisme d’action de Tyr et CO.
La CO est présente chez les plantes, quelques crustacés et les insectes.37 De nombreuses fonctions lui sont attribuées chez plantes supérieures en fonction de sa location.38 Elle est impliquée dans la photosynthèse et la coloration des fleurs. Sa fonction la plus vraisemblable serait son rôle dans la résistance des plantes supérieures aux agents pathogènes et les insectes. En effet, l’auto-polymérisation de l’o-quinone en mélanine polyphénolique aurait une action protectrice vis-à-vis des agents pathogènes ou insectes.
La CO est utilisée pour diagnostiquer la présence des catécholamines hormonale comme la dopamine, l’adrénaline ou noradrénaline.39
La CO a été identifiée la première fois en 1937.40 Par la suite, la CO a été purifiée d’une grande variété de plantes et de fruits (pomme de terre, pomme, épinard et litchi). En 1965, quelques isoenzymes de la CO ont été identifiées chez Ipomoea batatas (patate douce, ibCO). Une enzyme de 33 kDa a été séparée et nommée p-coumaryl-D-glucose hydroxylase et plus tard renommé Catéchol Oxydase.41
Deux fractions de masse molaire (une comprise entre 38 et 45 kDa, l’autre entre 55-60 kDa) sont trouvés en fonction de la localisation et l’organisme. Des enzymes de plus petites masses (30 kDa) sont également isolées, mais elles proviennent de la protéolyse de protéines matures.
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