Az ErbB2 homoasszociációjának vizsgálata konfokális mikroszkópos N&B módszerrel

4.8. Az ErbB2 homoasszociációjának vizsgálata konfokális mikroszkópos N&B  módszerrel 

Az ErbB2 homoklasztereinek vizsgálatát szérum éheztetett A4erbB2 sejtekkel kezdtük,  melyek 1,210⁶ ErbB1‐et és 9,510⁵ ErbB2‐mYFP‐t fejeznek ki. Stimulálatlan A4erbB2 sejtek  membránjában  az  ErbB2  mind  mikroszkópos,  mind  molekuláris  szinten  jelentős  klaszterizációs hajlamot mutatott (23‐24. ábra). A mikroszkópos képen látható klasztereket,  a molekuláris asszociátumoktól elkülönítendő, makroklasztereknek neveztük el. Az ErbB2‐

mYFP molekuláris fényessége szignifikánsan  magasabb  volt  a  makroklaszterekben, mint  azokon kívül, de mindkét helyen arra utaltak a mérések, hogy az ErbB2 nem monomerként  található (5. táblázat). Az ErbB1 homoasszociációs hajlamához képest az ErbB2 nagyobb  méretű  asszociátumokat  mutatott.  Ez  a  tendencia  összhangban  van  a  homo‐FRET  mérésekkel kapott eredményekkel. Egy olyan sejtvonalon (CHO‐erbB2mYFP), amely csak  ErbB2‐mYFP‐t fejez ki (310⁵ molekula/sejt), az ErbB2 szintén jelentős homoklaszterizációs  hajlamot  mutatott,  amely  még  az  A4erbB2  sejteken  tapasztaltnál  is  nagyobb  volt  (5. 

táblázat). Ennek valószínű magyarázata az, hogy az ErbB2 mellett más ErbB fehérjét is  kifejező  sejtekben  a  többi  ErbB  fehérje  heteroasszociáció  révén  csökkenti  az  ErbB2  homoklaszterizációját. 

22. ábra. Az ErbB1 nagy fényességű klaszterei kolokalizálnak a klatrinnal EGF stimulált F1‐10  sejteken. 

F1‐10  sejteket  100  nm  EGF‐fel  stimuláltunk  3  percig,  majd  fixálást  és  permeabilitálást  követően immunfluoreszcensen festettük a klatrin könnyű láncát (vörös csatorna). Az ErbB1‐

eGFP intenzitása zöld színnel jelenik meg. A két fehérje közötti korreláció a B részen látható  kontúrábra alapján r=0,6. Vonás=2 m. 

ErbB1-GFP

0 40 80

klatrin

0 100 200 300

400 B

r=0.60

éheztetett

0.04 éheztetett, m.k-en kívül

éheztetett, m.k-en belül

Atto565    WT ACP‐ErbB2  VPV‐ACP‐ErbB2

mol. fényesség  6. táblázat. Az ErbB2 fúziós konstrukciók molekuláris fényessége tranziensen transzfektált  HeLa sejteken. 

A tranziensen transzfektált sejteket két nappal a transzfekció után vizsgáltuk. Az ACP jel  esetében  Sfp  transzferáz  segítségével  Atto565‐tel  jelöltük  a  fehérjét.  A  feltüntetett  molekuláris  fényesség  az  átlagSEM  értékeket  jelenti  min.  3  mérésből  számítva.  A  zárójelekben az egy klaszterben levő ErbB2 átlagos számát tüntettük fel. Mivel a HeLa sejt 

30000 „sötét”, endogén ErbB2‐t fejez ki, ezért az egy klaszterben levő molekulák átlagos  számát erre korrigálni kellett. A transzfektált ErbB2 sejtenkénti száma 510⁵ és 310⁵ volt az  mYFP‐ és az ACP‐jelölt fehérjék esetében, ezért az egy klaszterben levő molekulák számát  0,94‐dal, ill. 0,9‐del osztottuk a két esetben. Az ACP‐fúziós fehérjék esetében még egy  korrekciós lépésre volt szükség, ami figyelembe veszi az ACP‐jel nem teljes jelölését Sfp  transzferázzal. Mivel méréseink szerint az általunk alkalmazott jelölési körülmények mellett  az ACP jel 60%‐a jelölődik, ezért az egy klaszterben levő molekulák számát 0,6‐del el kellett 

(A‐B)  Szérum  éheztetett  és  EGF  stimulált  A4erbB2  sejtek  fényesség‐átlag  intenzitás  kontúrábrája. Az A részen pirossal és zölddel jelölt téglalapokkal rendre a magas és alacsony  fényességű  pixeleket  szelektáltuk, amelyek  a 24.  ábra  C  és  D  részén  vannak  pirossal  feltüntetve. (C) Az A és B ábrák alapján készített fényesség hisztogramok a makroklaszteren  (m.k.) belüli és kívüli pixelekre. (D‐E) Tranziensen transzfekált Hela sejteken vizsgáltuk az 

Számtalan oka lehet az ErbB2‐mYFP ErbB1‐hez képest magasabb homoasszociációs  hajlamának: (i) a C‐terminális PDZ kötő régió (218); (ii) az mYFP‐t az ErbB2‐höz kapcsoló  linker szekvencia (185); (iii) az mYFP csoport (219). Ezen lehetőségek megvizsgálásához négy  új fúziós fehérjét állítottunk elő: ErbB2‐short‐mYFP, amelyben az mYFP és az ErbB2 között  egy dipeptid linker van; ACP‐ErbB2, amelyben az ErbB2‐höz egy Sfp transzferázzal jelölhető  ACP  szekvenciát  kötöttünk  C‐terminálisan  (tehát  extracellulárisan);  valamint  mindkét  szekvencia VPV deléciós mutánsát. A VPV szekvencia felelős a PDZ doménnel rendelkező  fehérjék  megkötéséért.  Az  ErbB2‐short‐mYFP  konstrukciót  HeLa  sejtekbe  transzfektálva  ugyanolyan  klaszterméreteket  kaptunk,  mint  A4erbB2  sejteken  a  N&B  analízissel  meghatározott molekuláris fényesség és a makroklaszterek jelenléte szempontjából is (23. 

ábra,  6.  táblázat).  Az  Atto565‐tel  kovalensen  jelölt  ACP‐ErbB2 ugyanolyan klasztereket  alkotott, mint  az  ErbB2‐mYFP  (23. ábra, 6. táblázat). Végül  összehasonlítottuk a VPV  mutánsok és a vadtípusú ErbB2‐short‐mYFP és ACP‐ErbB2 fehérjék klaszterizációs hajlamát,  ami  szintén  nem  mutatott  semmilyen  különbséget  (23.  ábra,  6.  táblázat).  Ezért  arra  következtettünk,  hogy  az ErbB2  jelentős  homoklaszterizációs  hajlama  a  molekula  saját  tulajdonsága, amelyben a PDZ kötő domén nem játszik szerepet. 

Ezt  követően  megvizsgáltuk,  hogy  az  ErbB2  makroklaszterek  milyen  más  membránfehérjével  mutatnak  kolokalizációt.  Az  egyetlen  pozitív  eredményt  szolgáltató 

ErbB2-mYFP

0 50 100

kaveolin

0 100 200 300

400 F

r=0.50

24.  ábra.  ErbB2  molekuláris  fényessége  eltérő  a  makroklasztereken kívül és belül. 

Szérum éheztetett A4erbB2 sejtek N&B analízise során 100  konfokális képet vettünk fel, aminek kiszámoltuk az átlagát  (A)  és  az  ErbB2‐mYFP  fényességét  (B).  A  magas  (C)  és  alacsony (D) fényességet mutató pixeleket pirossal jelöltük  a 23A. ábrán jelölt kapuknak megfelelően, és ezt a maszkot  rárétegeztük az átlagos intenzitást mutató képre. (E) Fixált  A4erbB2 sejteket permeabilizáltunk és a kaveolint immun‐

fluoreszcensen  jelöltük  (vörös  csatorna).  Az  ErbB2‐mYFP  fluoreszcenciája a zöld csatornában látható. (F) A kaveolin  és az ErbB2‐mYFP kolokalizációs analízise. 

fehérje a caveolin volt, amellyel az ErbB2 közepesen erős korrelációt mutatott (r=0.5, 24. 

ábra). Bár kvantitatív analízissel nem igazoltuk, feltűnő volt, hogy a caveolin rendszerint az  ErbB2 makroklaszterek perifériáján helyezkedett el (24. ábra). 

Végezetül megvizsgáltuk, hogy A4erbB2 sejtek EGF stimulációja milyen hatást gyakorol  az ErbB2 homoklasztereire. Eredményeink szerint az EGF hatására a makroklaszterekben  szignifikánsan csökkent az ErbB2 homoklaszterek mérete, míg a makroklasztereken kívül  nem volt jelentős változás (23. ábra, 5. táblázat). Pertuzumabbal előkezelt sejtekben az EGF  indukálta változások nem jelentek meg, ami arra utal, hogy az EGF által aktivált ErbB1  heterodimerizációja hatására csökken az ErbB2 homoklaszterek mérete (5. táblázat). Ezek az  eredmények is összhangban vannak az ErbB2 homo‐FRET‐tel történt karakterizálásával. (A  tárgyalt cikk a referencialistában: (36).)