Az ErbB fehérjék: klaszterizáció mindenek felett

A  transzmembrán  jelátvitel  vizsgálata  központi  jelentőségű a  sejt‐ és  molekuláris  biológiai kutatásokban, hiszen sejtek fiziológiás és patológiás aktivációs folyamatainak első  lépésének megismerése mind alapkutatási, mind orvosi szempontból rendkívül fontos. A  receptor tirozin kinázok a jelátviteli folyamatok egyik legrészletesebben tanulmányozott  résztvevői.  Közülük  az  epidermális  növekedési  faktor  (epidermal  growth  factor,  EGF)  receptorcsalád képezi ezen dolgozat legfontosabb tárgyát. Jelentőségét az adja, hogy kb. 40  éve ismert a receptort aktiváló növekedési faktor, az EGF (1), melynek receptora azóta a  legrészletesebben tanulmányozott és ismert transzmembrán receptor tirozin kinázzá vált. A  családnak  négy  tagja  van,  melyeket  ErbB1‐4  receptoroknak,  ill.  emberben  HER1‐4  (HER=human epidermal growth factor receptor) fehérjéknek neveznek. Az ErbB1 fehérje  azonos  a  család  névadó  tagjával,  az  EGF  receptorral  (EGFR).  Az  1970‐es  években  a  receptoraktiváció paradigmáját az EGFR‐ra írták le, amikor a családnak még csak ez a tagja  volt  ismert.  Eszerint  a  receptor  inaktív  állapotban  monomerként  van  jelen  a  plazmamembránban,  majd  a  ligand  (EGF)  megkötése  után  reverzibilisen  dimerizálódik,  amelyet  a  receptor  intracelluláris  kináz  doménjének  aktivációja  és  a  transzmembrán  jelátvitel aktivációja kísér (2). Azóta a kép sokkal árnyaltabbá és bonyolultabbá vált. Ennek  megértéséhez tekintsük át először röviden az ErbB fehérjék szerkezetét. 

Mind a négy fehérje hasonló felépítést mutat. Tartalmaznak egy 620 aminosavból álló  extracelluláris domént, egy rövid ‐helikális transzmembrán szegmenst és egy intracelluláris  részt. Ez utóbbi további részekre osztható: a membránhoz legközelebb a 40 aminosavat  tartalmazó juxtamembrán domén, majd a tirozinkináz domén és végül a C‐terminális végen a  foszfotirozint kötő effektor molekulák kötőhelyei találhatóak (3, 4). A 2000‐es évek elején az  összes  ErbB  fehérje  extracelluláris  részének  röntgenkrisztallográfiai  elemzése  feltárta  részletesebb szerkezetüket (5‐11). Az L1 (I) és az L2 (III) szubdomének leucinban gazdagok és  képesek  a ligand  megkötésére,  míg  a  ciszteinben gazdag  CR1  (II,  S1) és  CR2 (IV,  S2)  szubdomének a receptor dimerizációjában játszanak fontos szerepet. Ligandum hiányában  az ErbB2 kivételével a többi receptor ún. zárt konformációt vesz fel, amelyben a II. és IV. 

domének  között  intramolekuláris  híd  képződik.  Ez  a  kapcsolat  stabilizálja  ezt  a  térszerkezetet, és megakadályozza a dimerizációt, mivel a II. domén dimerizációs karjának  intramolekuláris kölcsönhatása kizárja a II. domének közötti intermolekuláris kapcsolódást. 

Zárt konformációban a ligandot kötő domének távol vannak egymástól, de képesek ligandot  kötni (12). Egyik elmélet szerint a ligand kötődés indukálja a zárt konformáció nyíltba való  átmenetét.  Más  elképzelések  szerint  a  receptor  konformációja fluktuál  a  zárt  és  nyílt  konformációk között, és a ligand kötődése „csak” stabilizálja a nyílt konformációt (13). 

Ligandum kötést követően az I. és III. domének egymáshoz közel kerülnek, felszakad a II‐IV  domének közötti intramolekuláris híd, és exponálódik a II. domén dimerizációs karja, amely  így intermolekuláris kapcsolatokat tud stabilizálni (1. ábra). 

  Az ErbB2 extracelluláris doménjének viselkedése több szempontból eltér a fentiektől. 

Egyrészt a receptor konstitutívan nyílt konformációban van, amiben a dimerizációs kar  exponált  (8). Másrészt  az  I.  és  III.  domének  közötti  ligandkötő zseb  túl  kicsi. A  fenti  strukturális információ összhangban van a már régóta ismert sejtbiológiai eredményekkel,  melyek szerint az ErbB2 nem képes növekedési faktort kötni, és a többi ErbB fehérje  preferált  heterodimerizációs  partnere  (14,  15).  Az  ErbB2  fehérje  konstitutívan  nyitott  konformációja  ellenére  nem  hajlamos  molekuláris  szintű  homodimerizációra,  amiért  valószínűleg extracelluláris doménjének negatív töltése és következményes elektrosztatikus  taszítása felelős (8). Egyes újabb eredmények szerint az ErbB2 extracelluláris doménje még  sincs  konstitutívan  aktív  konformációban,  mert  rejtett,  domének  közötti  gátló  kölcsönhatásokat tartalmaz (16). Tovább bonyolítja a képet az, hogy magas expressziós szint  mellett az ErbB2 mégis képez homoasszociátumokat, melyeket azonban valószínűleg nem a  már  leírt  dimerizációs  kar,  hanem  a  molekula  egyéb  részei  (pl.  transzmembrán  vagy  intracelluláris domének) vagy a lipid környezet stabilizálnak (17, 18).  

1. ábra. Az EGF receptor ligandfüggő aktivációja.  

Forrás: Ferguson, Biochemical Society Transactions, 2004, 32:742 

A fenti relatíve egyszerű modell, mely szerint az extracelluláris domén ligand indukált  konformáció‐változása okozza a dimerizációt, számtalan észlelést nem tud megmagyarázni. 

Valószínűleg az extracelluláris domének önmagukban nem képesek az ErbB fehérjék közötti  heterodimerizáció kiváltására (19), pedig a ligandumok ilyen klasztereket is létre hoznak (20,  21).  A  dimerek  összetételét  egyrészt  az  ErbB  fehérjék  expressziós  szintje,  másrészt  a  ligandum típusa határozza meg, amelyeket három csoportra oszthatunk (22, 23): 

a) EGF‐szerű  ligandok,  amelyek  leginkább  az  ErbB1‐hez  kötődnek:  EGF,  TGF 

(transzformáló növekedési faktor ), AR (amfiregulin), EPG (epigén). 

b) Neuregulinok, más néven heregulinok, melyek a neuregulin receptorokhoz (ErbB3 és  ErbB4) kötődnek: négy neuregulin gén ismert (NRG‐1=HRG, NRG‐2, NRG‐3, NRG‐4),  ezen belül a HRG és a NRG‐2 rendelkezik  és β izoformával is. 

c) HB‐EGF  (heparint  kötő  EGF‐szerű  növekedési  faktor),  BTC  (betacellulin)  és  EPR  (epiregulin), melyek egyaránt kötődnek az ErbB1‐hez és az ErbB4‐hez is. 

Tehát a növekedési faktor kötődik a saját receptorához, majd annak homo‐ vagy  heterodimerizációját  váltja  ki,  ami  a  receptor  aktivációjához  vezet.  A  dimerek  stabilizálásában a transzmembrán domén (24) és a kináz domén is részt vesznek (25). Az  utóbbi szerkezetének röntgenkrisztallográfiás vizsgálata érdekes betekintést engedett az  aktiváció  és  a  dimerizáció  közötti  kapcsolatba (26).  Ezek  szerint  a  receptor  monomer  állapotában  a  kináz  domén  a  Src  vagy  a  ciklin  dependens  kinázok  (CDK)  öngátolt  konformációjához  hasonlít.  A ligand  kötés  és az  extracelluláris  domének  dimerizációja,  melyet a transzmembrán domén konformációváltozása közvetít a membránon keresztül  (27), a kináz doméneket térbeli közelségbe hozza, és így azok egy aszimmetrikus dimert  hoznak létre. Ennek szerkezete hasonlít a ciklin‐CDK komplex konformációjához, tehát az  egyik EGFR kináz domén ciklin szerepét játssza és aktiválja a másik EGFR tirozin kinázát. Ezt  követően az aktivált receptor keresztfoszforilálja a másik receptor C‐terminális doménjében  levő tirozin oldalláncokat, amely a következő fejezetben leírtaknak megfelelően a jelátviteli  folyamatokat aktiválja. A fentiek tükrében értelmet nyer az, hogy egyáltalán miért van  szükség a receptor tirozin kinázok aktivációjához a dimerizációra. A több transzmembrán  szegmenssel rendelkező receptorok (pl. G fehérjéhez kapcsolt receptorok) esetében a ligand  megkötődése az extracelluláris domén konformáció‐változásán keresztül a transzmembrán  szegmensek átrendeződéséhez vezet, amely elégséges ahhoz, hogy kiváltsa az intracelluláris  domén konformációjának megváltozását. Bár az ErbB fehérjék esetében is kimutatható 

konformáció‐változás a transzmembrán doménben (27), egyetlen transzmembrán szegmens  konformációjának átalakulása valószínűleg nem elég ahhoz, hogy önmagában indukálja az  intracelluláris  domén  konformáció‐változását.  Ehelyett  a  receptorok  az  extracelluláris,  transzmembrán és intracelluláris domének együttműködése révén dimerizálódnak, ami a  kináz domének egymáshoz közelkerülése után kiváltja a keresztfoszforilációt.  

Bár a fenti monomerdimer átmenet ligand indukálta bekövetkeztét már egyedi  molekula szinten is kimutatták (28), ugyanezen közlemény megmutatta ezen elképzelés  korlátait. Kimutatták, hogy a monomer és dimer állapoton kívül létezik egy „összezárt” (co‐

confined)  pszeudo‐dimer  is,  amelyben  a  receptor  monomerek  molekuláris  közelségbe  kerülnek  egymáshoz,  de  távolságuk  mégis  nagyobb  annál,  hogy  közvetlen  monomer‐

monomer kontaktus tartsa össze  őket. Elképzelhető, hogy közös lipid doménben történő  megjelenés vagy citoszkeleton által indukált összetartás áll ezen pszeudo‐dimerek mögött  (28, 29). Több közlemény is kimutatta, hogy dimerek léteznek a sejtek felszínén ligandum  nélkül is, és ezen preformált dimerek preferenciálisan kötik meg a ligandumot (28, 30). 

Szintén  a  fenti  egyszerű  elképzelést  árnyalja  az,  hogy  az  extracelluláris  domén  zárt  konformációja  nem  elégséges  a  monomer  állapot  fenntartásához  (31).  Az  eddigiek  összefoglalásaként  kijelenthetjük,  hogy  bár  a  ligand  indukált  dimerizáció  sok  észlelést  megmagyaráz,  a  receptor  asszociációk  és  aktiváció  több  apróbb  részletét  megmagyarázatlanul hagyja. 

A legfontosabb ilyen „apróbb” részletek a klaszterizáció két aspektusát érintik:  

a. Egyrészt szinte bizonyosra vehető, hogy léteznek preformált, konstitutív homo‐ és  heterodimerek  is  (28,  30,  32).  Ezek  lehetnek  tranziensek  (28,  30)  vagy  feltételezhetően  hosszú  élettartamúak  (33).  Másrészt  ezen  dimerek  lehetnek  tényleges  fehérje‐fehérje  kölcsönhatás  által  összetartott  komplexek,  amelyek  ligandum kötés hatására konformáció‐változáson mennek keresztül (33, 34) vagy a  fentebb  már  leírt  pszeudo‐dimerek.  Jelentőségüket  valószínűleg  az  adja,  hogy 

„előasszociált” formában a receptor aktiváció gyorsabban következik be a növekedési  faktor kötődése után. A preformált dimerek vonatkozásában saját eredményeink is  relevánsak, amelyek a dolgozat „Eredmények és megbeszélés” fejezetében kerülnek  ismertetésre (35, 36). 

b. Másrészt a dimereknél magasabb rendű asszociátumok is léteznek, melyek mérete  több száz molekuláig terjedhet (37). Létezhetnek konstitutív módon (38) vagy ligand 

által indukáltan (39, 40). A ErbB fehérjék jelentősen különböznek egymástól mind  preformált dimer,  mind nagyobb méretű klaszterizációs képességükben. Részben  saját (35, 37), részben mások (41) eredményei alapján az ErbB2 és ErbB3 ilyen irányú  hajlama  jelentősen  nagyobb,  mint  az  ErbB1‐é.  A  klasztereket  összetartó  erők  valószínűleg indirektek: lehetnek citoszkeletális eredetűek vagy közös lipid doménbe  történő  particionálás  következményei.  Mivel  saját  eredményeink  jelentősen  hozzájárultak  ezen  klasztertípus  kvantitatív  leírásához,  lehetséges  biológiai  szerepüket részletesebben az „Eredmények és megbeszélés” fejezetben ismertetem  (35, 36, 42, 43). 

A  receptorok  által  kialakított  preformált  dimerek  és  nagyobb  méretű  klaszterek  ligandum  hatására  átrendeződnek,  közvetlen  molekuláris  kontaktusok  alakulnak  ki  a  receptorok  között,  melyeket  az  extracelluláris,  transzmembrán  és  kináz  domének  stabilizálnak.  Ennek  hatására  a  receptorok  C‐terminális  részén  keletkező  foszfotirozin  oldalláncok  segítségével  másodlagos  jelátviteli  folyamatok  aktiválódnak,  melyek  áttekintésére a következő fejezetben kerül sor.  

1.2. Az ErbB fehérjék biológiai jelentősége: transzmembrán jelátviteli folyamatok