4. Eredmények és megbeszélés
4.2. A proximitás ligációs vizsgálat (PLA) a protein klaszterizáció szemikvantitatív
4.2. A proximitás ligációs vizsgálat (PLA) a protein klaszterizáció szemikvantitatív mérőmódszere
Bár a FRET hatásfok a proteinek asszociációjával kvantitatív viszonyban levő paraméter, kiszámítása a legtöbb esetben különböző bonyolultsági fokú egyenletek vagy egyenletrendszerek megoldását igényli, amely számos biológiai alkalmazás esetében hátrányos. Ezért is övezte nagy várakozás a PLA technikát, amelyről kidolgozói azt állították, hogy a PLA szignál arányos a protein asszociáció mértékével, és így hallgatólagosan azt feltételezték róla, hogy kvantitatív mérőmódszerről van szó (151, 152). A mi érdeklődésünk azért is fordult a PLA technika felé, mert a FRET mérések magas autofluoreszcenciával rendelkező mintákon (pl. szövet metszetek) nem vagy nehézkesen alkalmazhatók, a PLA módszer a magas jel/zaj arány miatt viszont kiválóan használható ilyen körülmények között is. Mivel az új technika kvantitatív képességeit még nem tesztelték, ezért célul tűztük ki, hogy ezt szisztematikus vizsgálatokkal elemezzük.
Először az ErbB2 két epitópját jelöltük meg „priming” és „non‐priming”
oligonukleotiddal konjugált antitesttel (pertuzumab‐„priming”, trastuzumab‐„non‐priming”) SKBR‐3 sejteken a PLA jel generálásához, amit Cy5‐jelölt detektáló oligonukleotiddal vizualizáltunk. Célunk azt volt, hogy megvizsgáljuk, hogyan változik a PLA jel intenzitása az expressziós szint függvényében. Ehhez szükségünk volt egy, az ErbB2‐t a fenti antitestekkel
nem kompetáló módon megjelölő harmadik antitestre, amely immunfluoreszcensen karakterizálta a fehérje kifejeződési szintjét. Ehhez AlexaFluor488‐konjugált 7C2 antitestet használtunk. Áramlási citométeren megmértük a PLA jelet és az expressziós szintet jellemző antitest intenzitását, és kétdimenziós hisztogramon vizsgáltuk a kettő közötti összefüggést.
Megállapítottuk, hogy magas expressziós szintek mellett a PLA jel határozott telítési effektust mutat (5. ábra). Ha ugyanezt az intramolekuláris modellt teszteltük FRET segítségével, teljesen más kép tárult elénk. Ugyancsak SKBR‐3 sejteken megjelöltük az ErbB2‐t donorhoz konjugált trastuzumabbal és akceptorhoz konjugált pertuzumabbal.
Áramlási citometriás FRET mérésekkel meghatároztuk a FRET intenzitást (IDE a (16) vagy (30) egyenletekben) és ábrázoltuk a fehérje expressziós szintjének függvényében, amit a ki nem oltott (tehát FRET‐et nem mutató) donor intenzitásával jellemeztünk (6A. ábra). Szigorú lineáris korrelációt kaptunk a két mennyiség között. Ezzel szemben a FRET hatásfok nem változott a fehérje expressziós szintjének függvényében (6B. ábra).
5. ábra. A PLA jel telítődik az ugyanazon molekula két különböző epitópja elleni proximitás próbák esetében. Az ErbB2 két epitópját pertuzumab‐„priming” és trastuzumab‐„non‐
priming” antitesttel jelöltük meg a PLA jel méréséhez, amelyet Cy5‐jelölt detektáló oligonukleotiddal mértünk. Ugyanakkor az ErbB2 egy harmadik epitópját AlexaFluor488‐7C2 antitesttel jelöltük az ErbB2 expressziós szint detektálásához. A vörös trendvonalak a kétdimenziós hisztogramon az átlagos PLA jelet mutatják az ErbB2 expressziós szint függvényében. A kontúrszinteket logaritmikusan definiáltuk. A szélső ábrákon a fekete hisztogramok az AlexaFluor488‐7C2 intenzitás (fent) és a PLA szignál (jobbra) eloszlását mutatják. A szaggatott referenciavonalak a fekete hisztogramok átlagát jelölik. A kék hisztogram a felső ábrán a jelöletlen sejtek eloszlását mutatja az AlexaFluor488‐as csatornában, míg a jobb oldali ábrán a PLA szignált jeleníti meg negatív kontroll sejteken, amelyeket csak trastuzumab‐„non‐priming” antitesttel jelöltünk meg.
ErbB2 intenzitás (t.e.)
0 500 1000
PLA jel (t.e.)
0 500 1000 1500
0 500 1000
Relatív gyakoriság
0.00 0.01 0.50 0.55 0.60
Relatív gyakoriság (x102) 0 1 2 20 25 0
500 1000 1500
A fenti eredmények arra utalnak, hogy a PLA jel nem arányosan nő az asszociációt mutató fehérjék mennyiségével, és ez a telítési effektus olyan fehérje kifejeződési szinteknél jelentkezik, amelyek daganatos sejtekben nem ritkák. A FRET intenzitás (IDE) várhatóan a klaszterizálódó fehérjék mennyiségével arányos, így a FRET intenzitás és az expressziós szint közötti lineáris összefüggés ezt a feltevést és a FRET megbízható használhatóságát támasztja alá. Szintén emellett szól az is, hogy az intramolekuláris FRET értékek nem változtak az expressziós szint függvényében.
Hogy a PLA jel telítési hajlamát egy másik független és meggyőző módon demonstráljuk, szisztematikusan variáltuk a proximitási próbák denzitását a sejtfelszínen.
Ehhez a sejteket pertuzumab‐„non‐priming” antitesttel jelöltük meg, és a másik epitópot trastuzumab‐„priming” és fluoreszcens trastuzumab antitestek keverékével jelöltük meg.
Többféle mintát készítettünk, amelyekben a kétféleképpen jelölt trastuzumab antitest relatív arányát változtattuk, és így a fluoreszcens trastuzumabbal leszorítottuk a PLA jel generálásához szükséges trastuzumab‐„priming” antitestet. Az eredmények újból meggyőzően arra utaltak, hogy az oligonukleotiddal jelölt proximitás próbák denzitásának emelésekor a PLA jel telítésbe fut (7A. ábra). Ezen mérésekkel párhuzamosan ugyanolyan típusú sejteket donorral konjugált pertuzumabbal jelöltünk, és az akceptorral konjugált trastuzumabot leszorítottuk jelöletlen trastuzumabbal. Szintén egy mintasorozatot készítettünk, amiben a kétféle trastuzumab antitest aránya fokozatosan változott. A
ki nem oltott donor intenzitás (t.e.)
0 1000 2000
FRET hatásfok
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.7 B
ki nem oltott donor intenzitás (t.e.)
0 1000 2000
FRET intenzitás (t.e.)
0 1000 2000 3000 4000 A
6. ábra. Az intramolekuláris FRET hatásfok konstans, míg a FRET intenzitás lineárisan változik az expressziós szint függvényében. SKBR‐3 sejteket donor‐trastuzumab és akceptor‐
pertuzumab antitestekkel jelöltünk meg az ErbB2 két epitópja közötti intramolekuláris FRET áramlási citometriás méréséhez. A ki nem oltott donor intenzitást, a FRET intenzitást és a FRET hatásfokot sejtenként számoltuk ki. A kontúr szinteket logaritmikusan definiáltuk mindkét hisztogramon. A vörös trend vonal az átlagos FRET intenzitást (A) és az átlagos FRET hatásfokot (B) mutatja az expressziós szint függvényében.
várakozásnak és az előző eredményeknek megfelelően a FRET hatásfok szigorúan lineárisan változott a fluorofórral jelölt antitestek denzitásának függvényében (7B. ábra).
akceptor jelölés %-os aránya
0 20 40 60 80 100
FRET hatásfok
0.0 0.1 0.2 0.3
trastuzumab-P %-os aránya 0 20 40 60 80 100
PLA jel (t.e.)
0 50 100 150 200
250 A B
Tehát megállapítottuk, hogy a PLA módszer telítési effektust mutat, és ezért véleményünk szerint csak szemikvantitatív megközelítésként használható a protein asszociációk mérésére. Ezzel szemen a FRET az elméleti jóslatoknak megfelelően viselkedett kísérleteink során. Ez annak köszönhető, hogy a FRET jelenség szilárd fizikai alapokon nyugszik. Sejtes rendszerben a FRET hatásfok nem egyszerűen a donor‐akceptor távolságtól függ a (2) egyenlet szerint, hanem a molekuláris asszociátumok sztöchiometriájától és a klaszterben levő molekulák arányától. A fenti komplexitás ellenére számtalan olyan modellt alkottak már, többek között mi is, amely kvantitatív jóslatokat tesz a FRET mérések alapján a fehérje klaszterizációra vonatkozóan (35, 43, 204, 205).
Mivel a PLA szignál és a kísérleti körülmények közötti kvantitatív viszony ismeretlen, csak találgatni lehet a telítési effektus okaival kapcsolatban. Véleményünk szerint a sűrűn elhelyezkedő proximitási próbák által létrehozott sztérikus gátlás megakadályozhatja, hogy a PLA jelet generáló enzimek hozzáférhessenek az oligonukleotidokhoz. Ezenkívül a PLA jel
7. ábra. Telítési effektus PLA‐ban az antitest denzitás függvényében.
(A) SKBR‐3 sejteket pertuzumab‐„non‐priming” antitesttel változó arányban összekevert trastuzumab‐„priming” és AlexaFluor488‐trastuzumab antitestekkel jelöltünk meg. Az intramolekuláris PLA jelet a pertuzumab‐„non‐priming” és trastuzumab‐„priming”
antitestek között Cy5‐detektáló oligonukleotiddal mértük. A trastuzumab kötő epitóp trastuzumab‐„priming” antitest általi százalékos telítettségét úgy számoltuk ki, hogy az AlexaFluor488 csatornában mért intenzitást kivontuk a csak AlexaFluor488‐trastuzumabbal jelölt sejtek intenzitásából, és ezt normalizáltuk az utóbbi intenzitásra. (B) A pertuzumab kötő epitópot donorral konjugált pertuzumabbal telítettük, a trastuzumab kötő epitóphoz viszont változó mennyiségben jelöletlen és akceptorral konjugált trastuzumabot kötöttünk.
Ezt követően megmértük a donor‐pertuzumab és az akceptor‐trastuzumab közötti FRET‐et 20000 sejten áramlási citometriával, és az így meghatározott FRET értékeket ábrázoltuk az akceptorral konjugált antitest relatív denzitásának függvényében (100%=akceptor intenzitás a kompetáló antitest hiányában).
keletkezésében az RCA reakció során amplifikáció játszódik le, ami nem‐lineáris hatások megjelenéséhez vezethet. A feltételezést, mely szerint sztérikus gátlás és nem‐lineáris folyamatok játszódnak le a PLA reakcióban az amplifikációs fázis során, alátámasztja az a megfigyelés, hogy a PLA jel megjelenése „kvantált”, tehát fluoreszcens mikroszkópos képen nem homogén jel, hanem egységes méretű és fényességű foltok jelennek meg még intramolekuláris mérések során is (8. ábra). Bár nem várható, hogy egy molekula két epitópja közötti távolság heterogenitást mutat egy sejt felszínén, a PLA szignál mégsem egyenletes eloszlású. Ha az amplifikációs folyamat sztérikus okok miatt nem indulhat be, akkor a PLA jel teljesen hiányzik. Ha azonban beindul, akkor a PLA szignál egy teljesen kifejlett folttá érik.
Összegzésképpen elmondható, hogy a PLA folyamat rendkívüli jel/zaj arányáért valószínűleg ugyanaz a folyamat, az amplifikáció, felelős, mint ami a telítési effektust létre hozza. Ezért a PLA mérések esetén kapott eredményeket körültekintéssel kell értelmezni. (A tárgyalt cikk a referencialistában: (153).)
4.3. Áramlási citometriás homo‐FRET módszer kidolgozása a membránfehérjék