4. Eredmények és megbeszélés
4.6. Az ErbB1 és ErbB2 heteroklaszterizációjának kvantitatív jellemzése FSAB módszerrel
4.6. Az ErbB1 és ErbB2 heteroklaszterizációjának kvantitatív jellemzése FSAB módszerrel
Az előző fejezetben bemutatott FSAB módszer segítségével kvantitatív analízisnek vetettük alá az ErbB1 és ErbB2 heteroklaszterizációját nyugalomban levő és EGF stimulált
17. ábra. Az ErbB1 és ErbB2 homo‐ és heteroklasztereinek jellemzése FSAB módszerrel.
(A‐B) Szérum éheztetett SKBR‐3 sejteket az ábrán jelölt antitestekkel jelöltünk meg, és megmértük az ErbB1 (A) és az ErbB2 (B) homoklasztert formáló hányadát. A homoasszociátumot alkotó arány meghatározásához a 200 sec‐nál mért intenzitásokat helyettesítettük az (52)‐es egyenletbe (ennek magyarázatát l. 16. ábra). Így megállapítottuk, hogy az ErbB1 13%‐a, míg az ErbB2 83%‐a van homoklaszterekben. A mérések hibáját (SEM) az áttekinthetőség kedvéért csak minden ötödik mérési pontnál tüntettem fel. (C) A heteroklasztert formáló ErbB1 és ErbB2 receptorok száma stimulálatlan és EGF kezelt SKBR‐3 sejteken. Az ábra mind a szabad (nem heteroklaszterben levő), mind a heteroasszociált molekulák számát feltünteti. Az így kapott számok alapján megbecsültük az ErbB1‐2 heteroklaszterek átlagos összetételét kezeletlen és EGF stimulált sejteken.
SKBR‐3 sejteken. Olyan sejtekben, amelyeket egy éjszakán át alacsony szérumtartalmú médiumban tenyésztettünk, az ErbB1 40%‐a alkotott heteroasszociátumot az ErbB2‐vel, míg az ErbB2 10% volt heteroklaszterben az ErbB1 molekulákkal (17C, 18. ábra). Ahhoz, hogy a fenti arányszámokat receptor számokká tudjuk konvertálni, szükség volt arra, hogy az analizált sejteken meghatározzuk az ErbB1 és ErbB2 proteinek számát. Ehhez két mintát készítettünk SKBR‐3 sejtekből, az egyiket donorral konjugált trastuzumabbal, a másikat akceptor konjugált trastuzumabbal jelöltük meg. Meghatároztuk a háttérkorrigált fluoreszcencia intenzitás átlagát mindkét mintában 100 sejt lemérése alapján (ezeket ‚IdÚ‐
vel, ill. ‚IaÚ‐val jelöljük). Mivel a két mintában ugyanannyi sejtfelszíni fehérje lett megjelölve, ezért a két átlagos intenzitás jelölési aránnyal korrigált hányadosa megadja a donor és akceptor csatornákban azonos számú fluorofór által generált fluoreszcencia intenzitások hányadosát (Ra/d):
a d/ a d
d a
I L
R I L (54)
ahol Ld és La rendre a donor és akceptor jelölt antitestek jelölési aránya. Az FSAB kísérletek során a donor kép intenzitását megszoroztuk az Ra/d faktorral, hogy biztosítsuk, hogy a donor és akceptor képek azonos skálán legyenek. A fluoreszcencia intenzitások receptor számokká történő konvertálásához meghatároztuk az SKBR‐3 sejtek átlagos ErbB1 és ErbB2 expressziós szintjét áramlási citometriás mérésekkel Qifikit segítségével. Ezt követően az egyedi sejtek fluoreszcencia intenzitását a következő képlet segítségével konvertáltuk receptor számmá:
i Ii Qifi
N N
I (55)
ahol Ni és NQifi rendre a receptor szám az adott sejten és az átlagos receptor szám a populációban, Ii és ‚IÚ pedig rendre az adott sejt fluoreszcencia intenzitása és a sejtpopuláció átlagos fluoreszcencia intenzitása. Ezen kalibráció felhasználásával kaptuk a 18C. ábrán látható szabad és kötött receptor számokat.
A nyugalomban levő sejtek után megvizsgáltuk az ErbB1‐2 heteroasszociációt EGF stimulált sejteken. Az ErbB2 heteroklaszterizációt mutató hányada 2‐szeresére növekedett EGF kezelés hatására, míg az ErbB1 heteroasszociáló hányada nem változott jelentősen.
Értelmezésünk szerint ennek oka az, hogy az EGF nemcsak ErbB1 homoasszociációt, hanem ErbB1‐2 heteroasszociációt is kivált, ezért az ErbB1 heteroasszociáló hányada nem változik. A 4.4 fejezetben ismertetett homo‐FRET mérések szerint az ErbB2 nyugalomban tekintélyes
méretű homoasszociátumokat alkot, melyekből EGF stimuláció hatására a növekedési faktor által aktivált ErbB1 proteinek ErbB2‐t szakítanak ki. Ezt a feltételezést az FSAB mérések alátámasztották, hiszen az ErbB2 ErbB1‐gyel heteroklasztert formáló hányada tényleg szignifikánsan nőtt EGF stimulációt követően.
Az FSAB módszerrel lehetőségünk nyílt arra is, hogy a heteroklaszterek átlagos relatív összetételét, sztöchiometriáját megbecsüljük. Eszerint stimulálatlan sejtekben az ErbB1‐2 heteroklaszterekben az ErbB1 és ErbB2 arány 1:1,5, és ez 1:4‐re nő EGF stimuláció hatására. Összegzésképpen megállapíthatjuk, hogy az FSAB módszer betekintést nyújt a receptorok által alkotott heteroklaszterek összetételébe, és az általa szolgáltatott eredmények a homo‐FRET kísérletekkel összhangban vannak. (A tárgyalt cikk a referencialistában: (43).)
18. ábra. Reprezentatív képek az ErbB2 heteroasszociáló hányadának meghatározására.
SKBR‐3 sejteket AlexaFluor546‐Mab528 és Cy5‐trastuzumab antitestek keverékével jelöltünk meg. Az akceptor csatornában (A) felvett képen manuálisan indított vízfeltöltéses algoritmust használtunk a sejtmembrán azonosítására. A membránt a piros maszk jelöli a B képen. (C‐D) A ki nem oltott donor intenzitás a kiégetés előtt (C) és 200 sec‐os kiégető impulzus után (D). (E‐F) A FRET hatásfok a kiégetés előtt (E) és után (F). A FRET hatásfok színkódolt 0‐30%‐ig. (G‐H) A közvetlen gerjesztett akceptor intenzitás a kiégetés előtt (G) és után (H). A fluoreszcens képek (C, D, G és H) kontraszt fokozáson („contrast stretch”) mentek át, ezért a donor (C, D) és akceptor (G, H) képek intenzitásai nem összehasonlíthatóak, de a két donor és a két akceptor kép külön‐külön azonos skálán vannak.
fényesség
Az 1.6. fejezetben leírtak szerint a különböző, a fehérje asszociációkat karakterizáló technikák a klaszterizáció különböző dimenzióit jellemzik. Ezért bár a 4.4. fejezetben részletesen leírtuk az ErbB1 és ErbB2 receptorok homoasszociációit, egy másik módszerrel, a N&B analízissel is szerettük volna megerősíteni, ill. más távolságtartományban jellemezni ezeket a klasztereket. Másrészt többféle sejtvonal segítségével arra is választ szerettünk volna kapni, hogy a fehérjék expressziós szintje hogyan befolyásolja az asszociátumokat.
Az ErbB1 fehérje homoklasztereinek vizsgálatához ErbB1‐eGFP‐vel stabilan transzfektált sejtvonalakat használtunk. Először a magas expresszióval rendelkező daganatsejtek modelljének tekinthető F1‐4 sejtet vizsgáltuk, amely 6105 ErbB1 fehérjét fejez ki. A stimulálatlan, szérum éheztetett sejtek molekuláris fényesség értéke magasabb volt, mint a szolubilis, monomer eGFP‐jé, ami arra utal, hogy az ErbB1 fehérje már
19. ábra. Az ErbB1 homoklaszterizációja nyugalmi és stimulált sejteken.
(A) Szérum éheztetett, EGF stimulált F1‐4 sejtek és szolubilis monomer eGFP fényesség („brightness”) hisztogramjai. A sejteket három percig stimuláltuk 100 nM EGF‐fel. (B) Szérum éheztetett és kiégetett F1‐4 sejtek fényesség hisztogramja. A sejtek kiégetését addig végeztük, míg a maradék intenzitás a kezdetinek 20%‐a lett. (C) Szérum éheztetett és 3 percig EGF stimulált F1‐10 sejtek fényesség hisztogramjai. (D) Az EGF stimulált F1‐10 sejtek fényesség hisztogramját három Gauss görbével illesztettük, melyek összege tökéletesen illeszkedik a mért adatokra.