4. Eredmények és megbeszélés
4.15. A trastuzumab rezisztens JIMT‐1 sejteken a MUC4 transzmembrán mucin
4.15. A trastuzumab rezisztens JIMT‐1 sejteken a MUC4 transzmembrán mucin maszkírozza az ErbB2‐t
A receptor klaszterizáció, internalizáció és transzmembrán jelátvitel után a dolgozat hátralevő részében az ErbB fehérjékkel, mint potenciális terápiás célpontokkal fogok foglalkozni. Az 1.3‐1.4. fejezetekben leírtak szerint a trastuzumab a legáltalánosabb monoklonális antitest, amelyet az ErbB receptorok ellen használnak. A trastuzumabot elsősorban ErbB2‐t fokozottan kifejező emlőtumorok ellen használják, és bár jelentős terápiás előnyt jelent a konvencionális kemoterapikumokkal szemben, a rezisztencia jelentős kihívást jelent. A jelen fejezetben ismertetendő munka előtt a trastuzumab rezisztencia
mechanizmusát lényegében homály fedte. Az experimentális sejtbiológiai gyakorlatban alkalmazott emlőtumor sejtvonalak trastuzumab szenzitívek voltak, ami megnehezítette a rezisztencia jelenségének tanulmányozását. Kollaborációs partnerünk egy trastuzumab rezisztens, ErbB2‐t overexpresszáló tumorral rendelkező beteg pleurális folyadékgyüleméből előállította a JIMT‐1 sejtvonalat, amely in vitro is megőrizte rezisztens fenotípusát (184), melyet munkánk során próbáltunk karakterizálni.
A vizsgálatainkat megelőző években körvonalazott elképzelések szerint a trastuzumab hatásmechanizmusa mögött az antitest indukálta ErbB2 leszabályozódás, a rezisztencia mögött pedig az ErbB2 expresszió elvesztése áll. (Érdekes, hogy azóta, az 1.4. fejezetben ismertetettek szerint, mindkét feltételezés nagyrészt megdőlt.) Ezért ellenőriztük, hogy az ErbB és IGF1R expressziók, trastuzumab indukálta ErbB2 internalizáció és leszabályozódás tekintetében van‐e különbség a JIMT‐1 sejtvonal és más, trastuzumab szenzitív sejtvonalak között. Eredményeink szerint a paraméterek között nem volt olyan mértékű különbség, amely a biológiai válaszok eltérését magyarázhatta volna (7. táblázat).
JIMT‐1 SKBR‐3 BT‐474 MDA‐453
Expressziós szint ( ∙103)
ErbB1 160 190 16 60
ErbB2 620 1100 1450 620
ErbB3 10 42 20 18
ErbB4 0 0 0 2
IGF1R 5 4 9 5
trastuzumab indukálta
ErbB2 internalizáció 334% 251% 222% 162%
trastuzumab indukálta
ErbB2 leszabályozódás 405% 312% 272% 383%
7. táblázat. IGF1R és ErbB fehérjék expressziója, internalizációja és leszabályozódása JIMT‐1 és trastuzumab szenzitív sejtvonalakon.
Az expressziós szinteket Qifikit segítségével áramlási citometriával határoztuk meg. A következő antitesteket használtuk: Mab528 (ErbB1), OP15 (ErbB2), H3.90.6 (ErbB3), H4.77.16 (ErbB4), Ab1‐Clone 24‐31 (IGF1R). A trastuzumab indukálta válaszok mérésekor a sejteket 10 g/ml trastuzumabbal kezeltük, és az ErbB2 internalizáció és leszabályozódás mértékét szintén áramlási citometriával mértük. Az internalizációt 3 órás trastuzumab kezelés után vizsgáltuk, és a kezdeti kötött trastuzumab százalékos arányában adtuk meg. A leszabályozódást 48 órás trastuzumab kezelést követően határoztuk meg, és a kezdeti ErbB2 expressziós szint százalékában adtuk meg.
Felmerült bennünk az, hogy bár az ErbB2 intracelluláris részéhez kötődő antitest (OP15) segítségével meghatározott expressziós szint tekintetében a JIMT‐1 sejtek nem különböztek jelentősen a vizsgált szenzitív sejtvonalaktól, a trastuzumab kötődés mégis
gátolt lehet. Ezért megvizsgáltuk a különböző ErbB2 epitópok elérhetőségét különböző sejtvonalakon. Eredményeink szerint a membránhoz proximálisan kötődő (241) trastuzumab antitest jelentősen kisebb mértékben kötődött a JIMT‐1 sejtekhez, mint a szenzitív SKBR‐3 vagy BT474 sejtvonalakhoz (36. ábra). Az epitóp maszkírozása jelentős mértékben csökkent, ha teljes antitest helyett a trastuzumab Fab fragmentumával jelöltük a sejteket, és jelentősen kisebb mértékű volt abban az esetben is, ha az ErbB2‐t a membrántól disztálisan kötődő 2C4 antitesttel jelöltük ((241), 36. ábra).
OP15
trastuzum ab M
ab
trastuzum ab Fa
b 2C4 Expressziós szinttel normalizált intenzitás hányados
0.0 0.4 0.8 1.2 1.6
JIMT-1/SKBR-3 BT474/SKBR-3
Az eredmények alapján nyilvánvaló volt, hogy valamilyen faktor gátolja a trastuzumab sejtekhez kötődését. A tény, hogy az antitest molekulatömegének harmadával rendelkező Fab és a membrántól távolabb kötődő 2C4 antitest kötődését az ismeretlen faktor nem vagy csekélyebb mértékben gátolta, egyértelműen a membránban jelen lévő sztérikus gátló hatásra utalt. A patkány MUC4 molekula egy nagy molekulatömegű, extenzív mértékben glikozilált membránhoz kötött mucin, amely EGF‐szerű doménje segítéségével az ErbB2‐t aktiválni képes, és méretéből fakadóan gátolja antitestek ErbB2‐höz való kötődését (242‐
244). A jelenséget azonban humán tumorok vonatkozásában a humán MUC4‐gyel kapcsolatban még nem vizsgálták.
Igazoltuk, hogy a MUC4 mind mRNS, mind fehérje szinten magasabb szinten expresszálódik a JIMT‐1 sejteken, mint trastuzumab szenzitív sejtvonalakon (37. ábra). Ezt 36. ábra. A trastuzumab kötő epitóp maszkírozása JIMT‐1 sejteken.
Az ábrán feltüntetett antitestek kötődését elsődleges vagy másodlagos immunfluoreszcens módszerrel mértük meg áramlási citometria segítségével. A JIMT‐1/SKBR‐3 és JIMT‐1/BT474 hányadosokat az ErbB2 törtben szereplő két sejten mérhető expressziós hányadosával normalizáltuk, így a kapott hányados az antitest vagy Fab két sejthez való relatív kötődét fejezi ki.
követően a JIMT‐1 sejteken immunfluoreszcensen megfestettük a MUC4‐et és az ErbB2‐t trastuzumabbal jelöltük. A MUC4 expresszió és a trastuzumab kötődése között határozott negatív korrelációt találtunk, ami arra utalt, hogy a MUC4 ténylegesen gátolja a trastuzumab ErbB2‐höz való kötődését. Mind az immunfluoreszcens képeken, mind a kétdimenziós hisztogramon a magas MUC4 intenzitás és a magas trastuzumab intenzitás kizárták egymást (37. ábra).
Az epitóp maszkírozás egy újabb bizonyítékával szolgált a metalloproteázokat aktiváló APMA felhasználása. A maszkírozást nem mutató, trastuzumab szenzitív BT474 sejtvonalon az APMA előkezelés a trastuzumab kötődést 10‐szeresére, míg a maszkírozást mutató JIMT‐1 sejtvonalon 40‐szeresére növelte (38AB. ábra). Ez arra utal, hogy az APMA által
trastuzumab
0 20000 40000
MUC-4
0 20000 40000 60000
JIMT-1 SKBR-3 BT474
MUC4 aktin
A C
trastuzumabMUC4kompozit
JIMT-1 SKBR-3 BT474
tüdő
38 kDa 98 kDa
37. ábra. A MUC4 fokozott kifejeződést mutat JIMT‐1 sejtekben és lokális denzitása negatívan korrelál a trastuzumab kötődésével.
(A) A feltüntetett sejtvonalakból teljes sejt lizátumot készítettünk, majd a MUC4‐et felismerő 1G8 antitesttel blottoltuk. A membránt, megtisztítása („stripping”) után az aktint felismerő A4700 antitesttel jelöltük. (B) Reverz transzkripciós PCR‐ral a MUC4 mRNS‐t (felső csíkok, 414 bp) és kontrolként GAPDH mRNS‐t (glicerinaldehid‐foszfát‐dehidrogenáz, alsó csíkok, 204 bp) detektáltunk a feltüntetett sejtvonalakból és tüdő szövetből (pozitív kontroll). (C) Fixált és permeabilizált JIMT‐1 sejteket Cy5‐trastuzumabbal (piros csatorna) és a MUC4‐et felismerő 1G8 antitesttel, majd Cy2 GAMIG‐gal jelöltünk (zöld csatorna). A zöld nyilak olyan területeket jelölnek, ahol magas a MUC4 lokális denzitás, és alacsony a trastuzumab kötődése. A piros nyilak magas trastuzumab kötődésű és alacsony MUC4 denzitású pixeleket jelölnek. A képek kétdimenziós hisztogramja az ábra D részén látható.
B
D
aktivált metalloproteázok azon sejtfelszíni fehérjéket is hasítják, amelyek az ErbB2 maszkírozásáért felelősek. JIMT‐1 sejteken a trastuzumab kötődés szempontjából két populáció volt jelen (38C. ábra). Az APMA kezelés az alacsony szintű trastuzumab kötődéssel rendelkező populációban a trastuzumab kötődést a magas szintű kötődést mutató populáció szintjére emelte, ami amellett szól, hogy a két populációban az ErbB2 expressziója azonos, csak a maszkírozás tekintetében különböznek (38A. ábra).
Trastuzumab fluoreszcencia intenzitás 100 101 102 103 104
Relatív gyakoriság
0.000 0.004 0.008 0.012
Autofluoreszcencia 0 min APMA 15 min APMA
Trastuzumab fluoreszcencia intenzitás 100 101 102 103 104
Relatív gyakoriság
0.000 0.004 0.008 0.012
JIMT-1 BT474
2C4 fluoreszcencia intenzitás 100 101 102 103 104
Trastuzumab fluoreszcencia intenzitás
100 101 102 103 104
A B C JIMT-1
A MUC4 maszkírozásban betöltött szerepét RNS interferenciával bizonyítottuk be.
Bár a JIMT‐1 sejteknek csak kb. 15%‐át sikerült transzfektálni, a transzfektált szubpopulációban a MUC4 ellenes siRNS‐sel hatékonyan gátoltuk a MUC4 expressziót. A hatás specificitását úgy bizonyítottuk, hogy egy irreleváns, GFP ellenes siRNS a MUC4 expressziót nem befolyásolta, ill. a MUC4 ellenes siRNS‐nek semmilyen hatása nem volt egy irreleváns fehérje, az aktin kifejeződésére (39AB. ábra). A MUC4 siRNS‐sel kezelt JIMT‐1 sejteket a transzfekciót követően két nappal fluoreszcens trastuzumabbal festettünk meg, és a magas trastuzumab kötődést mutató szubpopuláció mérete jelentősen megnőtt. A
növekmény nagysága megfelelt a MUC4 ellenes siRNS‐sel transzfektált populáció arányának (15%). A transzfektált mintát a trastuzumab festődés alapján áramlási citometriás szeparálással két populációra választottuk, és mindkét frakcióból húszezer sejtet izoláltunk.
A két populációban megvizsgáltuk a MUC4 expresszióját Western blottal, és a magas szintű 38. ábra. Az ErbB2 APMA indukálta feltárása.
A‐B. JIMT‐1 és BT474 sejteket 1 mM APMA‐val kezeltünk, majd fluoreszcens trastuzumabbal jelöltük és a kezeletlen, ill. a festetlen kontrollokkal párhuzamosan áramlási citometriával analizáltuk. (C) JIMT‐1 sejteket kettősen jelöltünk AlexaFluor488‐2C4‐gyel és AlexaFluor633‐
trastuzumabbal, majd áramlási citometriával vizsgáltuk a két fluoreszcens antitest kötődése közötti korrelációt.
trastuzumab kötődéssel jellemezhető szubpopuláció jelentősen alacsonyabb MUC4 expressziót mutatott (39C. ábra).
Összefoglalásul elmondható, hogy a kísérletek meggyőzően bizonyították, hogy a MUC4 JIMT‐1 sejtekben maszkírozza az ErbB2 trastuzumab kötő epitópját. Eredményeink hozzájárultak a trastuzumab rezisztencia egy valószínűleg klinikai szempontból is releváns mechanizmusának feltárásához. (A tárgyalt cikk a referencialistában: (113).)
4.16. A CD44 ligand hialuronsav szintén maszkírozza az ErbB2 trastuzumab kötő