A fehérjeasszociációk mérésének jelentősége és módszerei

1. Irodalmi háttér

1.6. A fehérjeasszociációk mérésének jelentősége és módszerei

1.6. A fehérjeasszociációk mérésének jelentősége és módszerei

A jelátviteli folyamatokban a különböző méretű fehérje klaszterek képződése alapvető jelentőségű, amit az ErbB receptorokkal kapcsolatban a „Bevezetés” eddigi fejezeteiben bemutattam. Hasonló klaszterek a másodlagos jelátvivő proteinek között is képződnek, mint pl. a KSR fehérje által alkotott platform a MAPK útvonalon (149). Ezért érthető, hogy a klaszterizáció mérése az e témával foglalkozó sejtbiológiai és biofizikai témájú projektekben központi jelentőségű. Ezen fejezet célja, hogy az egyes módszerek részleteinek bemutatása és minden eljárás felsorolása nélkül rendszerbe szervezze azokat, és rámutasson arra, hogy mik az egyes megközelítések előnyei és hátrányai. A módszerek közül azok, amelyek a tárgyalt cikkek szempontjából lényegesek, részletesebb bemutatásra kerülnek.

A módszereket célszerű két nagyobb csoportra osztani:

1. Kvalitatív‐szemikvantitatív eljárások: Ezeket a módszereket alkalmazzák a legkiterjedtebben a sejt‐ és molekuláris biológiai kutatások során. Előnyük az egyszerűség, ill. az általános felszereltségű sejtbiológia laborban való megvalósíthatóság, de több potenciális hátulütővel is rendelkeznek.

a. Koprecipitáció, kémiai keresztkötés, co‐capping, Western blot: a legegyszerűbb és legáltalánosabban alkalmazott módszerek. Csak kvalitatívan tudják a fehérjék közötti kölcsönhatásokat jellemezni, és még ezeket az eredményeket is körültekintően kell értelmezni. Amennyiben a módszer antitesttel vagy kémiai ágenssel történő keresztkötést igényel, reális annak az esélye, hogy olyan molekulák is keresztbe kötődnek, amelyek az élő sejtben

nem álltak kölcsönhatásban egymással. A mesterségesen indukált kölcsönhatásokon kívül az a veszély is fenyeget, hogy az élő sejtből történő kivonás során nemcsak ilyen arteficiális aggregátumok képződnek, hanem a gyengén kölcsönható klaszterek szétesnek (150).

b. Proximitás ligációs vizsgálat (proximity ligation assay, PLA) (151, 152): Az eljárás alapja az, hogy a vizsgálandó két fehérjét megjelölik oligonukleotidhoz kapcsolt antitestekkel. Amennyiben a két fehérje egymás közelségében van, akkor a később hozzáadott lineáris összekötő oligonukleotidok segítségével cirkuláris DNS képződik, amely RCA (rolling circle amplification, gördülő cirkuláris amplifikáció) reakció segítségével sokszorozható. Ezen termékhez fluoreszcensen jelölt oligonukleotid hibridizálható, amely megjelöli a kölcsönható fehérjék helyzetet. A módszer kvantitativitásának hiányáról az

„Eredmények és megbeszélés” fejezetben részletesen lesz szó (153).

c. Nagy áteresztőképességű szűrésre képes technikák (pl. élesztő két hibrid (yeast two hybrid, Y2H), bimolekuláris fluoreszcencia komplementáció (bimolecular fluorescence complementation, BiFC)) (154‐156): Ezen módszerek alapja, hogy azt a fehérjét („csali”, „bait”), aminek az interakciós partnereit ki szeretnék mutatni, vagy egy transzkripciós faktor (Y2H esetében) vagy egy fluoreszcens fehérje (BiFC esetében) egy fragmentumához kapcsolják, míg a keresett interakciós partnereket („áldozat”, „prey”) a transzkripciós faktor vagy a fluoreszcens fehérje másik doménjével fuzionáltatják. Ha a csali és az áldozat kölcsönhat egymással, akkor a transzkripciós faktor vagy a fluoreszcens protein két doménje is egymásra talál, és így helyre áll a két részre hasított protein aktivitása: a transzkripció vagy a fluoreszcencia detektálható. Felmerül annak a lehetősége, hogy a kölcsönhatást nem a „csali” és az „áldozat” fehérje hozza létre, hanem a transzkripciós faktor két alegysége vagy a fluoreszcens fehérje N‐ és C‐

terminális doménje. További limitáció, hogy a fragmentálódott fluorofór vagy transzkripciós faktor rekonstruálása irreverzibilis.

2. Kvantitatív eljárások: Míg az előző pontban említett módszerek esetében esély sincs arra, hogy a kölcsönhatást kvantitatívan jellemezzük, addig az itt tárgyalandó eljárások az interakció valamilyen aspektusát kvantitatív szempontból jellemzik.

Lényeges, hogy az egyes módszerek eltérő érzékenységet mutatnak a különböző méretű és stabilitású klaszterekre. Ez ellentmondó eredményekhez vezethet, amelyeket a módszerek korlátainak ismeretében fel lehet oldani. Általánosságban elmondható, hogy ezen módszerek kifinomult fizikai és matematikai mérőmódszereket vagy kiértékelési eljárásokat foglalnak magukba, amelyek gyakran elijesztik a sejt‐ és molekuláris biológiai közösség nagy részét (140, 154, 157, 158).

a. Kolokalizáció mérése (159): Amennyiben két fluoreszcensen jelzett fehérje eloszlása fluoreszcens mikroszkópos felvételen hasonló (korrelál egymással), akkor feltételezhető, hogy a két molekula között valamilyen kölcsönhatás van.

Számtalan tanulmány bizonyította már, hogy a kolokalizáció kvalitatív mérése (zölddel és vörössel jelölt fehérjék esetében sárga pixelek megjelenése) félrevezető lehet, ezért kizárólag a kvantitatív kiértékelés a mérvadó. Ennek széleskörűen elterjedt változata a Pearson féle korrelációs koefficiens, de sok más paraméter is számítható.

b. Fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) (160‐162): A FRET, amelynek rövidítését néha leírója alapján Förster típusú rezonancia energia transzfernek értelmeznek, egy fluoreszcens, ún. donor molekula és egy nem feltétlenül fluoreszcens akceptor molekula közötti dipól‐dipól kölcsönhatás segítségével történő energia átadás (160, 163, 164). A folyamat során a gerjesztett donor molekula foton emisszió nélkül energiát ad át a környezetében levő akceptornak. A folyamat feltételei a következők: (1) a donor és az akceptor távolsága 2‐10 nm legyen; (2) a donor és az akceptor orientációja megfelelő legyen, amit a ² orientációs faktorral jellemeznek (165‐167); (3) a donor normalizált emissziós és az akceptor abszorpciós spektrumai egymással kellő mértékű átfedést mutassanak, amit a J átfedési integrállal írnak le. A FRET sebességi állandóját a következő egyenlet adja meg:

k_FRET konst J n  ^⁴ k R_f ^⁶² (1)

ahol n a közeg optikai törésmutatója, R a donor‐akceptor távolság és kf a fluoreszcencia sebességi állandója. Az R és a ² tagokon kívül a többi paraméter konstansnak tekinthető, azonban ahhoz, hogy a FRET valóban

távolság mérő módszerré válhasson, bizonyítani kell, hogy az orientációtól való függés elhanyagolható. A legtöbb esetben FRET‐et molekuláris sokaságon mérnek, ahol a fenti kFRET sebességi állandó átlagolódik. A konstans és a konstansnak tekinthető tagok (J, n, kf) mellett a változó paraméterek átlagolódását kell megvizsgálni. Ezek átlagolódhatnak egymástól függetlenül (‚R^‐6Ú‚²Ú) vagy szorzatként (‚R^‐6²Ú). A legtöbb esetben jó közelítéssel a független átlagolódás következik be, amikor a donor és az akceptor gyors rotációs mozgást végez. Ebben az esetben a ² átlagát, 2/3‐ot helyettesítenek az egyenletbe (dinamikus átlagolódás), és a sebességi egyenlet a következőképpen egyszerűsödik (165‐167):

k_FRET konst R ^⁶ (2)

azaz a FRET sebességi állandója csak a távolságtól függ. A FRET kompetál a többi relaxációs mechanizmussal, a fluoreszcenciával és a többi, nem fluoreszcens átmenettel, melyek sebességi állandói rendre kf és knf. A FRET hatásfok (E) megadja azon gerjesztett donor molekulák arányát, melyek FRET hatására relaxálódnak:

^FRET

FRET f nf

E k

k k k

   (3)

A távolságfüggés világos kifejezése érdekében többször használják a következő egyenletet:

6 0

6 6

E R

R R

  (4)

ahol R0 az ún. kritikus Förster távolság, amely egy adott donor‐akceptor párra megadja azt a távolságot, ahol E=50%.

A FRET gyakorlati alkalmazhatóságát meghatározza az, hogy milyen mérhető folyamatokban manifesztálódik. Ezt külön kell a FRET kétféle változata esetében tárgyalni.

(1) Hetero‐FRET: konvencionális FRET‐nek is szokták nevezni. Ebben az esetben a donor és akceptor molekulák spektroszkópiailag különböznek egymástól. Ebben az esetben a FRET a donor fluoreszcencia intenzitásának

csökkenéséhez (fluoreszcencia kioltás, „quenching”) és a donor fluoreszcencia élettartamának a csökkenéséhez vezet (dinamikus kioltás):

1 ^DA 1 ^DA

D D

E F



    (5)

ahol F és  a donor fluoreszcencia intenzitását és fluoreszcencia élettartamát jelentik, a D alsó index arra utal, hogy csak a donor van jelen, a DA pedig arra, hogy a donor mellett akceptor is van a rendszerben. A donor élettartamának csökkenése még több mérhető változáshoz vezet. (i) A donor rövidebb fluoreszcencia élettartama miatt kevesebb idő áll a donor rendelkezésére, hogy a gerjesztett állapotban forogjon, ezért kevésbé depolarizálódik a fluoreszcencia: nő a donor fluoreszcencia anizotrópiája (168):

1 1

r E r

r r



 

 (6)

ahol r0 a donor határanizotrópiája, rD és rDA pedig a donor anizotrópiája az akceptor nélkül és jelenlétében. A határanizotrópia az az anizotrópia érték, amely egy „befagyott” molekula esetében mérhető, amely nem végez forgást a fluoreszcencia élettartamnak megfelelő idő alatt. (ii) A donor kioltás egy másik detektálási módszere az akceptor fotoelhalványításán (photobleaching) alapszik. Ennek során megmérik a donor fluoreszcencia intenzitását akceptor jelenlétében (FDA), majd az akceptort magas intenzitású gerjesztő fénnyel kiégetik. Mivel ezáltal megszűnik az akceptor abszorpciós képessége, az akceptor kiégetés után mért donor intenzitás megfelel az akceptorral nem jelölt minta fluoreszcencia intenzitásának (FD), és a FRET az (5) egyenlet alapján kiszámítható (169, 170). (iii) A donor élettartamának csökkenése a donor fotoelhalványítási kinetikáját is lassítja (171, 172). Ennek oka az, hogy a fotoelhalványítás a gerjesztett állapotból kiinduló változás, amely a donor fluoreszcens tulajdonságainak elvesztéséhez vezet. Mivel a donor fluoreszcens élettartamának csökkenése miatt a donor kevesebb időt tölt a gerjesztett állapotban, a fotoelhalványítás sebessége lassul. Egy másik gondolatmenet is hasonló következtetésre vezet. A donor fotoelhalványodása

előtt meghatározott számú fotont tud kibocsátani, amit a FRET nem befolyásol. Az emittált fotonok száma arányos a fluoreszcencia‐idő grafikon alatti területtel. Ennek értelmében, ha a donor fotoelhalványítási idejét akceptor jelenlétében TDA‐val és nélküle TD‐vel jelöljük, a FRET hatásfok kiszámítható:

0 0





D DA

AUC AUC

I T I E T E T



     (7)

A hetero‐FRET mérésének egy másik lehetőségét adja az akceptor fluoreszcenciájának növekedése (szenzitizált emisszió), amennyiben az akceptor fluoreszcens. Mivel a donor és az akceptor közötti szinte mindig van spektrális átfedés, ennek kiszámítása mindig az átvilágítások ismeretében kell, hogy történjen, és a műszertől, ill. a festékektől függ (161). Ennek vázlatos leírása az „Anyagok és módszerek” fejezetben található.

(2) homo‐FRET: ebben az esetben a donor és az akceptor spektroszkópiailag megkülönböztethetetlen, azaz ugyanolyan kémiai szerkezetű és ugyanabban a környezetben levő molekula. A folyamatnak ugyanazok a feltételei, mint a fentebb felsoroltak, azzal a kiegészítéssel, hogy a J átfedési integrál itt egyazon molekula abszorpciós és normalizált emissziós 2. ábra. A donor fotoelhalványításon alapuló FRET mérés értelmezése a grafikon alatti területek (AUC – area under the curve) alapján. A kék görbe a donor fotoelhalványítási kinetikáját, míg a piros a donor akceptor jelenlétében mért fotoelhalványítási kinetikáját mutatja.

spektruma között értendő. Ennek van egy további fontos következménye. A donor molekula által homo‐FRET‐tel gerjesztett akceptor egy további homo‐

FRET kölcsönhatásban lehet donor, és így az energia szétterjed a klaszterben (3a. ábra). Ez lehetőséget teremt arra, hogy homo‐FRET mérésekkel a klaszter méretét meghatározzuk. Az első molekula fluoreszcencia intenzitása ID(1‐E), és IDE energiát ad át a sorban következő molekulának, amely IDE(1‐E) intenzitást emittál, és IDE² mennyiségű energiát a harmadik molekulának ad.

Általánosságban az n‐dik molekula által kibocsátott intenzitás az IDE^n‐1(1‐E) képlettel írható le, és a molekuláris sokaság teljes intenzitását ennek a végtelen mértani sorozatnak az összege adja, ami ID‐vel egyenlő.

Következésképpen nincs fluoreszcencia kioltás, a folyamat sem intenzitás, sem élettartam méréssel nem detektálható (3b. ábra). A homo‐FRET egyetlen mérhető manifesztációja a donor fluoreszcencia anizotrópiájának csökkenése.

Egy fluoreszcens molekula anizotrópiáját polarizált fénnyel történt gerjesztését követően az határozza meg, hogy a molekulák emissziós dipólusai mennyire maradnak rendezettek a fluoreszcencia élettartam alatt. Az emissziós dipólusokat egy kúppalásttal szokás reprezentálni. A rendezetlenséget a kúppalást nagyobb nyílásszöge mutatja, amit előidézhet pl. rotációs mozgás. Mivel a homo‐FRET segítségével olyan molekulák is gerjesztődnek, melyek emissziós dipólusa nem párhuzamos a donor molekuláéval, a molekuláris sokaság által kibocsátott fotonok rendezettsége, anizotrópiája csökken (3c‐d. ábra). Mivel az anizotrópiát nemcsak a FRET határozza meg, ezért molekuláris asszociáció mértékével való korreláltatása problémás. Ennek kiküszöbölésére az anizotrópiát vagy időfüggően mérik (128) vagy a fluorofór koncentrációtól való függését elemzik. Ennek részletei az „Eredmények és megbeszélés” fejezetben kerülnek tárgyalásra.

c. Fluoreszcencia korrelációs spektroszkópia (FCS), „number and brightness”

analízis (N&B) (173, 174): Az FCS esetében egy konfokális mikroszkóp detekciós térfogatában a fluoreszcencia fluktuációját mérik. Ha egy fehérjét jelölünk fluoreszcensen, akkor annak homoasszociációját lehet detektálni. FCS esetében a fluoreszcencia autokorrelációs függvényét számítják ki, ami több paraméter mellett függ az egy pixelben levő molekuláris egységek számától (ND). Ha a diffúzión kívül más folyamat nem járul hozzá a fluoreszcencia intenzitás (F(t)) fluktuációjához, az autokorrelációs függvényt a következő egyenlet írja le két dimenzióra korlátozott mozgás esetén:

     

 

1 1

D D

F t F t

G F t N

  



   

 (8)

ahol  az időt, a D a diffúziós korrelációs időt jelenti, míg a ‚Ú zárójel időbeli átlagolást jelöl. A molekuláris egység lehet egy darab fluorofór (monomer), de ha klaszterről van szó, akkor a dimer, trimer, stb. számít molekuláris egységnek, feltéve, hogy együttesen lépnek be és hagyják el a detektálási térfogatot. Ha ismerjük a detektálási térfogatban a detektálási idő alatt gyűjtött fotonok átlagos számát, akkor ennek és az ND‐nek a hányadosa megadja a molekuláris egység molekuláris fényességét (M, a detekciós idő alatt a detektálási térfogatban emittált és detektált fotonok száma). Ha ismerjük egy fluorofór molekuláris fényességét (_F), akkor _M/_F megadja a

homo‐FRET D

B C D

donor foton gerjesztő

fény

D D

homo‐

FRET

3. ábra. (A) Polarizált fénnyel történő gerjesztés hatására kialakult homo‐FRET spektroszkópiailag azonos molekulák között. A kettős nyilak reprezentálják az oda‐vissza is lejátszódó homo‐FRET kölcsönhatást (D = donor). (B) Homo‐FRET esetében a donorok sokasága által kibocsátott összes fluoreszcencia intenzitás nem csökken. (C‐D) A fluoreszcencia anizotrópia FRET jelenléte nélkül (C) és homo‐FRET esetében (D). A donor forgáskúpjának szélessége arányosan változik a molekula rotációs diffúziós mozgásával.

I_DE

IDE²

ID(1‐E)

I_DE(1‐E)

IDE²(1‐E)

homo‐oligomerizáció fokát. Ezenkívül az autokorrelációs függvény illesztéséből kapott diffúziós korrelációs idő is függ az asszociáció mértékétől, de ebből a fentiekben leírt módon megszámolni a klaszterben levő fluorofórok számát nem lehet (173).

A N&B mérések az FCS alapelvére épülnek (174). Az elv megértéséhez vizsgáljuk meg egy pixel fluoreszcencia intenzitásának varianciáját. Ennek két komponense van: (1) az egy pixelben levő molekulák számának fluktuációja (N2); (2) a foton detektálás Poisson statisztikája (D2). A teljes varianciát (²)a két komponens összege adja meg:

²_N²_D² (9)

Definiáljuk a látszólagos fényességet (B) a következő képlet szerint:

   

 

 ²  ²  ^N² ^D²

B I N N (10)

ahol ‚NÚ a molekuláris egységek átlagos száma a detektálási térfogatban,  pedig a molekuláris fényességük. Statisztikai megfontolások alapján belátható, hogy

_N² ² N , _D²  N (11)

ezért

    

 

 

 ^N² ^D²  ² N N  1

B N N (12)

Tehát egy pixelben a variancia és az átlagos fluoreszcencia intenzitás hányadosából ki lehet számítani a molekuláris egység molekuláris fényességét (), aminek a fluorofór molekuláris fényességével történő összehasonlítása megadja a homoasszociáció fokát. Megjegyzendő, hogy mind az FCS, mind a N&B módszernek létezik kétszínű változata, amellyel két különböző fluorofórral jelölt molekula heteroklaszterizációja mérhető kvantitatív módon (175, 176).

d. Diffúzió mérésén alapuló módszerek (egyedi partikulum követés (single particle tracking, SPT), fluoreszcencia visszatérés fotoelhalványítás után (fluorescence recovery after photobleaching, FRAP)) (177, 178): Mindkét módszer esetében a jelölt (FRAP esetében fluoreszcensen, SPT esetében

fluoreszcensen vagy arany gömbbel) molekulák diffúzióját követjük, és a diffúziós állandó fentebb említett, asszociációtól (tehát hidrodinamikai sugártól) való függéséből lehet az oligomerizáció mértékére következtetni. Ez SPT esetében úgy történik, hogy az egyedi molekulák diffúziós pályáját kirajzolják, és az átlagos négyzetes elmozdulás (‚r²Ú) kiszámításával a következő egyenlet alapján meghatározzák a diffúziós állandót (D) (178):

r² 4Dt (13)

A fenti egyenlet kétdimenziós diffúzió esetében használható. FRAP esetében egy megfigyelési területen egy erős lézerimpulzus segítségével elhalványítják (photobleaching) a fluorofórok fluoreszcenciáját, majd egy alacsony intenzitású lézer segítségével monitorozzák a fluoreszcencia visszatérését, amelynek illesztéséből a diffúziós állandó meghatározható (177). Mindkét diffúzió mérésén alapuló módszer esetében figyelembe kell venni azt, hogy a diffúzió a sejtmembránban nagyon gyakran anomális (l. 1.5 fejezet). Kétszínű SPT mérések esetében a két fluorofór pályájának követésével további információ is nyerhető. Egy fluorofór helyzete nanométeres pontossággal meghatározható (l. következő pont), és így a két vizsgált festék esetében megállapítható, hogy mikor kerülnek molekuláris távolságba egymástól. A folyamat statisztika analíziséből a dimerizáció kvantitatívan jellemezhető (28, 29).

e. Lokalizáció mérésén alapuló módszerek (stimulált emisszió depléciós mikroszkópia (stimulated emission depletion microscopy, STED), sztochasztikus optikai rekonstrukciós mikroszkópia (stochastic optical reconstruction microscopy, STORM), fotoaktivációs lokalizációs mikroszkópia (photoactivation localization microscopy, PALM)) (179‐182): Az itt röviden ismertetendő technikák azon a feltevésen alapulnak, hogy a molekuláris asszociációk jellemezhetők akkor, ha az egyedi molekulák pozícióját nanométeres pontossággal ismerjük. Ilyenkor két molekula akkor tekinthető egymással asszociáltnak, ha néhány nanométerre vannak egymástól. Hogy mindez fluoreszcens mikroszkóppal keresztülvihető legyen, át kell lépni az ún.

Abbé féle határt, ami a diffrakción alapuló leképező rendszerekben a feloldóképességet limitálja:



 0.6 d sin

n (14)

ahol d a két még elkülöníthető fluorofór távolsága,  a hullámhossz (konfokális mikroszkópiában a gerjesztési), n a tárgy és az objektív közötti közeg törésmutatója,  pedig az objektív félnyílásszöge (183). A három technika közül a STED esetében egy lézernyalábbal a diffrakció által meghatározott területen gerjesztik a fluorofórokat, majd egy fánk alakú nyaláb segítségével indukált emisszióval depletálják a gerjesztett energiaszintet. A depletáló nyaláb intenzitásának beállításával elérhető, hogy a gerjesztett molekulák egy néhány nanométeres átmérőjű területre korlátozódjanak (179).

A PALM és a STORM technikák közös, de a STED‐től eltérő elven alapulnak. Mindkettő esetében azt használják ki, hogy egy fluorofór helyzete nanométeres pontossággal meghatározható, ha képe nem fed át más fluorofórok képével. Ehhez azt kell elérni, hogy a fluoreszcensen jelölt mintában egyszerre a fluorofórok töredéke legyen gerjeszthető állapotban. A PALM esetében ezt fluoreszcens proteinek fotoaktiválásával, míg a STORM esetében cianin típusú festékek fotokapcsolásával („photo‐switching”) érik el (180‐182).

A kvantitatív módszerek nyilvánvaló előnye, hogy számszerűsítik a protein klaszterizáció valamilyen aspektusát. Azonban tekintettel kell lenni arra, hogy a fent ismertetett módszerek érzékenységét jelentősen befolyásolja, hogy a vizsgált asszociátum milyen időskálán stabil és milyen méretű (hány protein van benne és hány nanométer az átmérője). Ennek jelentőségére több közlemény mellett mi is felhívtuk a figyelmet (140, 154, 157). Röviden, bizonyos módszerek tényleges molekuláris asszociátumokat mutatnak ki, amikor a vizsgált fehérjék között közvetlen kontaktus alakul ki. Ide leginkább a strukturális vizsgálómódszerek (röntgen krisztallográfia, NMR) tartoznak. A hetero‐FRET a fehérjék 2‐10 nm‐es szeparációs távolsága esetén utal a kölcsönhatás jelenlétére, de itt figyelembe kell venni azt, hogy ha a vizsgálat ideje alatt a két fehérje távolsága fluktuál, de néha a FRET távolságon

belül vannak egymástól, akkor a kölcsönhatást ki lehet mutatni. Tehát a FRET jelezhet valódi molekuláris asszociációt vagy egybezártságot („co‐confinement”) is, amikor a fehérjéket valami nem engedi messzire eltávolodni egymástól. A homo‐FRET az energia klaszterben való szétterjedése miatt érzékenyebb a nagyobb méretű klaszterekre, mint a hetero‐FRET. Az FCS és a hasonló elven működő eljárások (pl.

N&B) szintén jelezhetnek valódi molekuláris asszociációt és egybezártságot is, de itt az egybezártság dimenzióját a mikroszkóp feloldóképessége határozza meg. Tehát ha a vizsgált fehérjék 100‐200 nm‐es kalitkába vannak zárva, akkor a kölcsönhatás észlelhető ezekkel az eljárásokkal, míg FRET (homo‐ és hetero‐) esetében ez már nem valószínű. A diffúzió mérésén alapuló eljárások inkább az egybezártságot, semmint a közvetlen molekuláris interakciókat mutatják ki, bár az SPT esetében a molekulák diffúziós pályájának statisztikai elemzésével valódi molekuláris interakciók létére sikerült bizonyítékot szolgáltatni (28, 29). A nem kvantitatív eljárásokat nehéz a fenti

„térképre” ráhelyezni, de általánosságban az mondható el, hogy többségük az egybezártságot mutatja ki. A fentiek ismerete nélkülözhetetlen olyan ellentmondó kísérleti eredmények értelmezéséhez, amikor az egyik egy kölcsönhatás jelenlétére utal, míg a másik erre utaló bizonyítékot nem talál.

In document 2012 Debreceni Egyetem, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet E B A D . N P AKADÉMIAI DOKTORI ÉRTEKEZÉS (Pldal 21-33)