Az elisidepsin elsődleges támadáspontja a sejtmembrán

Bár az előző fejezetben tárgyalt eredmények alapján bebizonyosodott, hogy az ErbB  fehérjék  minden  valószínűség  szerint  semmilyen  elsődleges szerepet  nem játszanak  az  elisidepsin iránti érzékenység meghatározásában, másodlagos hatásoknak azonban mégis ki  lehetnek téve. Ezért megvizsgáltuk, hogy elisidepsin kezelést követően az ErbB fehérjék  mikroszkópos és szubmikroszkópos eloszlásában milyen változások következnek be. ErbB1‐

eGFP‐t kifejező A4erbB1 és ErbB2‐mYFP‐t kifejező A4erbB2 sejtek elisidepsin kezelése a két  fehérje  eloszlásában  nem  okozott  számottevő  változásokat  konfokális  mikroszkópos  vizsgálatok alapján (32. ábra). Hasonló következtetésre jutottunk az ErbB2‐vel kapcsolatban,  amikor CHO‐ErbB2‐3 sejteken az ErbB2 receptort immunfluoreszcensen tettük láthatóvá (32. 

ábra). Ezzel ellentétben az elisidepsin az ErbB3 fehérje (CHO‐ErbB2‐3 sejteken) és az ErbB3‐

citrine fúziós fehérje (A4erbB3 sejteken) eloszlásában jelentős változást indukált már 30  32. ábra. Lipid tutaj asszociált és 

ErbB fehérjék eloszlása  kontroll  és elisidepsin kezelt CHO és A431  sejtekben. A zöld tónusú képek  konfokális  mikroszkópos  képso‐

rozatok  ortogonális  nézeteit,  a  pirosan  színezett  képpár  egyetlen  konfokális  szeletet  mutat. A PLAP‐t, ill. az ErbB2‐t és  ErbB3‐t  CHO  sejtekben  immun‐

fluoreszcensen  festettük,  míg  A431 sejtekben az ErbB1‐3 fehér‐ 

jéket fluoreszcens proteinek segítségével tettük láthatóvá. A sejtek kezelése 10 M  elisidepsinnel történt 30 percig. A méret indikátorok 10 m‐nek felelnek meg.   

perc  alatt:  a  kezelés  előtti  tipikus  plazmamembránban  való  elhelyezkedés  diffúz  intracelluláris és vezikuláris, néhol nukleáris lokalizációra változott (32. ábra). 

ErbB2‐2 ErbB3‐3

ErbB2‐3 ErbB3‐2

FRET %

0 5 10 15 20

elisidepsin nélkül 1 µM elisidepsin 15 µM elisidepsin

  A  fénymikroszkópos  vizsgálatok  nem  adnak  felvilágosítást  a  fehérje  interakciók  molekuláris szintjéről. Ezért áramlási citometriás FRET mérésekkel meghatároztuk, hogy az  ErbB2  és  ErbB3  homo‐  és  heteroasszociációja  milyen  átalakulásokon  megy  keresztül  elisidepsin hatására. Eredményeink szerint mindkét fehérje homoasszociációját az elisidepsin  dózisfüggő módon csökkentette, míg a két protein heteroasszociációjára nem volt hatással  (33. ábra).   A heteroasszociáció vizsgálatakor a kapott FRET hatásfok jelentősen magasabb  volt akkor, amikor az ErbB2‐t jelöltük akceptorral konjugált antitesttel. Mivel a használt CHO‐

ErbB2‐3 sejteken az ErbB2 magasabb expressziót mutat, ez a különbség összhangban van a  FRET hatásfok akceptor mennyiségtől való függésével (228). 

Következőekben megvizsgáltuk, hogy milyen hatása van az elisidepsinnek lipid tutaj  markerek eloszlására. Először a GPI‐kötött GFP‐re (GFP‐GPI) gyakorolt hatását analizáltuk a  fehérjével  tranziensen  transzfektált  A431  sejteken.  A konfokális  mikroszkópos  mérések  szerint az elisidepsin az ErbB3‐hoz hasonló átrendeződést okozott a GFP‐GPI eloszlásában  (32. ábra). Bár a GFP‐GPI gyakran alkalmazott lipid tutaj marker, felmerült bennünk, hogy  nem biztos, hogy hűen reprezentálja az endogén lipid tutaj asszociált fehérjék eloszlását és  elisidepsinre adott válaszát. Ezért A431 sejteken elvégeztük egy endogén lipid tutaj asszociált  fehérje, a PLAP (placentáris alkalikus foszfatáz), immunfluoreszcens festését kontroll és  33. ábra. Elisidepsin által indukált változások az ErbB2 és ErbB3 homo‐ és heteroasszo‐

ciációiban. 

Áramlási  citometriás  FRET  mérésekkel  meghatároztuk  az  ErbB2  és  ErbB3  homoasszociációját (ErbB2‐2 és ErbB3‐3) és heteroasszociációikat kontroll, ill. 1 M és 15 

M elisidepsinnel kezelt CHO‐ErbB2‐3 sejteken. Az ErbB2‐3 jelölés arra utal, hogy az ErbB2  ellenes antitest volt donorral, míg az ErbB3 ellenes akceptorral jelölt, az ErbB3‐2 jelölés  esetében a fluoreszcens jelek sorrendjét felcseréltük. 

elisidepsin kezelt sejteken. Eredményeink szerint ez a lipid tutaj asszociált fehérje is a már  korábban látott jellegzetes redisztribúciót mutatta elisidepsin hatására: diffúz intracelluláris,  néhol vezikuláris és nukleáris lokalizáció volt felismerhető (32. ábra). 

Idő (perc)

0 5 10 15 20

TMA‐DPH anizotrópia

0.25 0.26 0.27 0.28

DMSO

10 µM elisidepsin

Idő (perc)

0 5 10 15 20

Laurdan GP

0.38 0.40 0.42

B A

Idő (perc)

0 5 10 15 20

TMA‐DPH anizotrópia

0.25 0.26 0.27 0.28 0.29 0.30 0.31

Idő (perc)

0 5 10 15 20

Laurdan GP

0.38 0.40 0.42

0.44 D

C

A431 sejtekSKBR-3 sejtek

  Mivel  a  mérések  alapján  úgy  tűnt,  hogy  az  elisidepsin  több  membránfehérje  mikroszkópos szintű eloszlását és molekuláris kölcsönhatásait átalakítja, felmerült annak a  lehetősége,  hogy  mindezek  a  változások  másodlagosan  következnek  be  valamilyen  elsődleges  effektus  után.  Feltételeztük,  hogy  az  elisidepsin  támadáspontja  a  plazmamembrán, hiszen ekkor elképzelhető, hogy a fehérjék lipid környezetének átalakulása  sokrétű változásokat okoz a membránfehérjék eloszlásában. Az olyan gyógyszerek, amelyek  támadáspontja a sejtmembrán, gyakran okoznak átalakulást a membrán fluiditásában vagy  rendezettségében  (229‐231).  Két  fluoreszcens  indikátort  használtunk  a  membrán  struktúrájának  vizsgálatához.  A  TMA‐DPH  fluoreszcencia  anizotrópiája  a  membrán  fluiditásáról, míg a Laurdan generalizált polarizációja (GP) a membrán hidratáltságáról, ill. 

rendezettségéről ad információt (125, 194, 196, 197, 232). Az A431 és az SKBR‐3 sejteken az  34. ábra. Elisidepsin által indukált változások a plazmamembrán struktúrájában. 

A TMA‐DPH anizotrópiájában és a Laurdan generalizált polarizációjában 10 M elisidepsin  által kiváltott változásokat követtük fluoriméteren SKBR‐3 és A431 sejteken. Kontrollként az  elisidepsin oldószerét, DMSO‐t használtuk. Az ábrán három független mérés eredményének  átlaga (SEM) látható. 

elisidepsin  1‐2  perc  alatt  jelentős  csökkenést  indukált  a  TMA‐DPH  fluoreszcencia  anizotrópiájában, míg a Laurdan GP‐jában ezzel ellentétes irányú változást okozott (34. 

ábra). Általában a membrán fluiditásának növekedését (amelyre a TMA‐DPH fluoreszcencia  anizotrópia emelkedése utal) a rendezettség csökkenésének kellene követnie, amely esetben  a Laurdan GP‐jának csökkenni kellene. A két paraméter ellentétes irányú változása arra utal,  hogy olyan strukturális átalakulás történt, amely a rendezettséget és a fluiditást is növelte. 

Ez  több közlemény  alapján a folyékony rendezetlen doménekre, azaz a lipid  tutajokra  jellemző (125, 233). Az a tény, hogy a membrán szerkezetében feltárt fenti változásokat az  elisidepsin 1‐2 perc alatt kiváltja, arra utal, hogy ez ténylegesen a gyógyszer elsődleges  hatása, és a többi változás ennek a következménye lehet. 

  Kísérleteinkkel  többé‐kevésbé  egy  időben  két  közlemény  is  megjelent,  amelyek  alátámasztják a fentebb körvonalazott elképzeléseket. Molina‐Guijarro és mtsai kimutatták,  hogy az elisidepsin valóban a plazmamembránhoz kötődik (234). Továbbá Herrero és mtsai  kísérletei feltárták, hogy az elisidepsin hatásossága korrelál a zsírsav 2‐hidroxiláz (fatty acid  2‐hydroxylase, FA2H) szintjével (235). A hidroxilált zsírsavak és más lipid tutajokra jellemző  lipidek  (elsősorban  koleszterin  és  szfingolipidek)  hidrogénkötések  hálózatával  kompakt  struktúrát hoznak létre, amely csökkenti a membrán hidratáltságát (124, 236). Az elisidepsin  valószínűleg  a  hidroxilált  zsírsavakkal  alkot  hidrogénkötéseket  (235),  és  ezáltal  a  koleszterinhez  hasonlóan  hidrogénkötések  kialakítása  révén  segíti  elő  a  lipid  tutajok  képződését, és végül a membrán permeabilizálódását, amelyet propidium jodid felvételi  kísérleteink támasztanak alá (30. ábra). 

  Felmerül a kérdés, hogy az elsődleges hatásokat követő másodlagos effektusok miért  mutatnak bizonyos szelektivitást egyes fehérjékre. Az magától értetődő a fentiek alapján,  hogy a lipid tutaj asszociált fehérjék (GFP‐GPI és PLAP) miért rendeződnek át elisidepsin  hatására, de hogy az ErbB fehérjék közül miért csak az ErbB3 sejtszintű eloszlása változott  meg,  és  hogy  a  molekuláris  kölcsönhatások  közül  miért  csak  az  ErbB2  és  ErbB3  homoasszociációi változtak,  jelenleg nyitott  kérdések.  Feltételezéseink szerint  mindazon  fehérje komplexek, melyek fenntartásában a lipid környezet szerepet játszik, szenzitívebbek  az  elisidepsin  hatására,  mind  a  közvetlen  protein‐protein  interakciókon  alapuló  asszociátumok. Saját méréseink szerint az ErbB2 (35), Landgraf és Eisenberg kísérletei szerint  pedig az ErbB3 is nagyméretű klasztereket alkot (41). Mivel a 4.9. fejezetben javasolt modell  alapján ezek összetartásában a lipid környezet fontos szerepet játszik, nem meglepő, hogy a 

két fehérje homoasszociációit jellemző FRET értékek csökkentek elisidepsin hatására. Ezzel  szemben  a  heteroasszociátumok  fenntartásában  feltételezhetően  elsősorban  közvetlen  fehérje‐fehérje kölcsönhatások vesznek részt, amelyeket az elisidepsin nem borít fel. 

  Nagyon fontos, de szintén nyitott kérdés az, hogy ilyen általános támadásponttal  rendelkező gyógyszer, mint az elisidepsin, hogyan mutathat specificitást daganatsejtekre. 

Elképzeléseink szerint ezen jelenség mögött a daganatsejtekre jellemző lipidösszetételbeli  módosulások állhatnak, amelyek a telített/telítetlen zsírsavak arányának növekedését, a  kevésbé komplex gangliozidok felhalmozódását és a hidroxilált zsírsavak mennyiségének  növekedését is magukba foglalják (237‐239). E változások, különösen az utolsó, állhat az  elisidepsin daganat specificitásának hátterében. (A tárgyalt cikk a referencialistában: (227).)   

4.14. Az ErbB2 és ErbB3 koexpresszió hatása ErbB1 ligand indukált internalizációjára