A lipid tutajok és az ErbB3 hatása az ErbB2 homoklaszterizációjára

4.10. A lipid tutajok és az ErbB3 hatása az ErbB2 homoklaszterizációjára 

Az  előzőekben  ismertetett  eredmények  feltárták,  hogy  az  ErbB  fehérjék  milyen  klasztereket alakítanak ki. A 4.9. fejezetben körvonalazott modell alapján ezek létrejöttében  nemcsak  közvetlen  fehérje‐fehérje  kölcsönhatások,  hanem  a  lipid  környezet  hatásai  is  szerepet játszanak. Ezért megvizsgáltuk, hogy az ErbB2 esetében ebben van‐e szerepe a lipid  tutajoknak.  Először  azt  kellett  eldönteni,  hogy  az  ErbB2  receptor  a  lipid  tutajokban  helyezkedik‐e el. Erre a kolera toxin B alegységének (CTX‐B) fluoreszcensen jelölt változatával  történő vizsgálatokat választottuk (143). Eredményeink szerint az ErbB2 és a lipid tutajokat  jelölő CTX‐B fluoreszcenciája korrelált egymással (26A. ábra). A kolokalizáció kvantitatív  jellemzésére a Manders koefficienst használtuk (159). Eszerint az ErbB2 és a lipid tutajok  közötti átfedés 776%‐os volt akár az ErbB2‐t, akár a CTX‐B jelet használtuk referenciának. A  képek egyértelműen bizonyították azt is, hogy az ErbB2 mikroszkóppal is látható klasztereket  alkot, amelyek megfelelnek a N&B mérések során látott makroklasztereknek, és a korábban  pásztázó  közeli  mező  optikai  mikroszkóppal  („scanning  near‐field  optical  microscopy”,  SNOM) látott asszociátumoknak (37). Mivel ezekben a makroklaszterekben az ErbB2 lokális  denzitása sokkal nagyobb, mint a plazmamembrán többi részén, a tömeghatás törvénye  alapján az várható, hogy a makroklaszterekben az ErbB2 homoasszociációjának mértéke  nagyobb  lesz. Ezt  a  feltételezést  FRET mérések  segítségével  kívántuk  ellenőrizni,  de a  makroklasztereken kívül a fluoreszcencia intenzitás túl alacsony volt megbízható mérések  elvégzéséhez. A jel/zaj arány növelésére két módszert használtunk. Egyrészt az egymás  mellett levő pixeleket szummáltuk („pixel pooling”), másrészt nagyméretű ROI‐kat jelöltünk  ki a makroklasztereken kívül és belül. Mindkét módszer arra utalt, hogy a klaszterekben 

található magas ErbB2 denzitás ellenére nem nagyobb az ErbB2 homoasszociáció mértéke a  klasztereken belül, mint kívül (pixel pooling: FRET a klasztereken kívül: 18±3%, klasztereken  kívül: 16±3%;  ROI‐k  segítségével: FRET a  klasztereken kívül: 16±2%,  klasztereken belül: 

17±2%).  

  26. ábra. Az ErbB2 eloszlásának és asszociációjának viszonya a lipid tutajokhoz. 

(A) SKBR‐3 emlőtumor sejteken a lipid tutajokat FITC‐CTX‐B‐vel jelöltük (zöld csatorna). Az  ErbB2‐t  Cy3‐4D5  Fab  és  Cy5‐4D5  Fab  keverékével  jelöltük  FRET  mérésekhez.  A  Cy3  fluoreszcenciája a vörös csatornában látható. A jelölést jégen hajtottuk végre, hogy a CTX‐B  által  indukált  oligomerizációt  és  internalizációt  meggátoljuk.  A  sárga  szín  megjelenése  kolokalizációra utal. (B) Akceptor fotoelhalványítás segítségével az A részen feltüntetett  sejten meghatároztuk a FRET hatásfokot, amelyet kéktől vörösig tartó színskálán tizedes  törtben tüntettünk fel. A fehér téglalappal jelölt területeken jól látható az inverz korreláció a  zöld intenzitás (CTX‐B által jelölt GM1 gangliozid) és az ErbB2 homoasszociációja között. (C)  SKBR‐3  sejteket  37C‐on  jelöltünk  FITC‐CTX‐B‐vel,  majd  jégen  Cy3‐4D5  Fab‐vel.  A  kép  színkiosztása ugyanaz, mint az A részen. 

  Ezen eredmények arra utaltak, hogy a makroklaszterekben valamilyen tényező gátolja  az ErbB2 homoasszociációját. Ezért akceptor fotoelhalványításon alapuló FRET segítéségével  megmértük  a  pixelenkénti FRET‐et  ErbB2  homoasszociációra.  Tapasztalatunk  szerint  az  ErbB2 homoasszociáció mértéke negatív korrelációt mutat a tutajokban található, a CTX‐B  által megjelölt  GM1  gangliozidok denzitásával (26B, 27A. ábra).  Ez  összhangban van a  gangliozidok ErbB1 asszociációra gyakorolt negatív hatásával (145) és a homo‐FRET mérések  alapján  felállított  azon  hipotézisünkkel,  hogy  a  közepes  vagy  nagyméretű  ErbB2  homoklaszterekben  az  ErbB2  inaktív  formában  van  jelen.  Az  ErbB2  magas  denzitása  konstitutív asszociációra és aktivációra vezet (18). A lipid tutajok lipid környezetének ErbB2  homoasszociációt gátló hatása ezt a konstitutív aktivációt gátolja vagy csökkenti, biztosítva  azt, hogy az ErbB2 homoklaszterekben levő molekulák ne aktiválódjanak. Az aktiváció majd  csak akkor következhet be, amikor ligandum által aktivált más ErbB fehérjék kiszakítják az  ErbB2‐t a homoklaszterekből és heteroasszociátumokat képeznek egymással. 

27. ábra. Az ErbB2 homoasszociáció negatívan korrelál a CTX‐B és az ErbB3 lokális  denzitásával. 

(A)  SKBR‐3  sejteket  megjelöltünk  FITC‐CTX‐B‐vel,  ill.  Cy3‐  és  Cy5  konjugált  4D5  Fab  keverékével  jégen,  majd  megmértük  az  ErbB2  homoasszociációt  akceptor  fotoelhalványításos FRET segítségével, és ezt korreláltattuk a FITC‐CTX‐B intenzitásával. (B)  SKBR‐3 sejteken az ErbB2‐t FITC‐ és Cy3 konjugált 4D5 Fab keverékével jelöltük, az ErbB3‐at  H3.90.6 monoklonális antitest másodlagos jelölésével Cy5 konjugált másodlagos Fab‐vel. Az  ErbB2  homoasszociációt  donor  fotoelhalványításos  FRET  segítségével  mértük  meg  a  makroklasztereken belül, és ezt korreláltattuk az ErbB2 és az ErbB3 lokális denzitásával. 

  A lipid környezet hatásán kívül minden olyan fehérje, amely az ErbB2‐vel kölcsönhat,  képes lehet arra, hogy kompetíció révén gátolja az ErbB2 homoasszociációját. Az SKBR‐3  sejtek az ErbB2 legfontosabb heterodimerizációs partnerét, az ErbB3‐at is kifejezik. Ezért  megvizsgáltuk,  hogy  az  ErbB3  lokális  denzitása  milyen  hatást  gyakorol  az  ErbB2  homoklaszterizációjára. Az ErbB2‐t donorral konjugált és akceptorral konjugált antitestek  keverékével jelöltük meg, míg egy harmadik fluoreszcens festékkel az ErbB3‐t jelöltük, majd  pixelenként megmértük a két fehérje expressziós szintjét és az ErbB2 homoasszociációját  FRET mérésekkel. A kiértékelést csak a makroklasztereken belül végeztük el, és ez arra utalt,  hogy az ErbB2 homoasszociációja arányos az ErbB2 lokális expressziós szintjével, és negatív  korrelációt  mutat az ErbB3  lokális denzitásával (27B, 28. ábra). Mindkét  összefüggés a  tömeghatás törvényének érvényesülését bizonyítja az ErbB2 homoasszociációja esetében. 

A lipid tutajokban többféle különböző típusú fehérje fordul elő. Ezek közül az egyik a GPI‐

horgonyzott proteinek osztálya, melyekről kimutatták, hogy a pentamer CTX‐B által okozott  lipid tutaj keresztkötés hatására nagyobb méretű foltokba koncentrálódnak a CTX‐B‐vel  együtt (143). Megvizsgáltuk, hogy ez a stabil lipid tutaj asszociáció az ErbB2 esetében is  felismerhető‐e. SKBR‐3 sejteket kezeltünk fluoreszcensen jelölt CTX‐B‐vel 37°C‐on, majd 

CTX-B fluoreszcencia intenzitás 0 50 100 150 200 250

ErbB2 homoasszociáció (FRET hatásfok)

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

50 100 150 200

0 50 150100 200 ErbB2 homoasszociáció (FRET hatásfok)

ErbB3 fluoreszcencia intenzitás ErbB2

fluore szcen

cia intenzitás

A B

megjelöltük őket fluoreszcens anti‐ErbB2 antitestekkel.  A  konfokális  mikroszkópos  felvételek tanúsága szerint a keresztkötött lipid tutajok hátrahagyták az ErbB2‐t, hiszen a két  fluoreszcens jel nem mutatott jelentős átfedést (26C. ábra). A kvantitatív analízis szerint a  Manders  koefficienst  a  CTX‐B  kezelés  285%‐re  csökkentette.  Eszerint  a  GPI‐kötött  fehérjékkel ellentétben az ErbB2, és elképzelhető, hogy más transzmembrán fehérjék is,  kevésbe  statikusan  kötöttek  a  lipid  tutajokhoz,  hiszen  a  GM1  gangliozid  CTX‐B  általi  keresztkötése  az  ErbB2  lipid  tutajbeli  lokalizációját  megszünteti.  (A  tárgyalt  cikk  a  referencialistában: (42).) 

4.11. Lipid tutajok CTX‐B‐vel való keresztkötésének hatása az ErbB2 biológiai