IV.1.1 Csírázásbiológiai vizsgálatok
Csírázásbiológiai vizsgálatainkat laboratóriumi körülmények között végeztük. Vizsgálataink kiterjedtek a Taraxacum officinale kaszatok éves csírázási ritmusára, a magnyugalom (jelenlétének vagy hiányának) megállapítására, fény és hőmérséklet csírázásban betöltött szerepére, a talajtani tényezők közül az ozmotikus potenciál (szárazságstressz) és NaCl koncentráció (sóstressz) vizsgálatára. Továbbá vizsgáltuk a különböző fitohormonok csírázásban betöltött szerepét (gátló vagy serkentő hatásként jelentkeznek), és a növény allelopatikus képességét különböző fű-, és pillangós virágú fajok csírázására vonatkozólag. Csírázásbiológiai vizsgálatainkat magkórtani vizsgálatok is övezték.
Vizsgálataink célja volt további értékes, hiánypótló és a közeljövőben felhasználható adatokat nyerni a Taraxacum officinale kaszatjainak csírázásbiológiáját tekintve.
IV.1.1.1 Magnyugalom (primer dormancia) vizsgálata
A kaszatokat 2005. november hónapban gyűjtöttük be Keszthelyen, útmenti területről. A kaszatokat a gyűjtést követően tisztítottuk, papírzacskóba tettük és felhasználásig szobahőmérsékleten tároltuk. A gyűjtést követően másnap laboratóriumi körülmények között kísérletet állítottunk Petri-csészében, kezelésenként 100 kaszattal, 4 ismétlésben. A kaszatokat termosztátban, sötétben és állandó (20°C-on) csíráztattuk, értékelés a beállítást követő 14. napon történt.
IV.1.1.2 Éves csírázási ritmus vizsgálata
A kaszatokat 2004. május-június hónapban gyűjtöttük Keszthelyen, útmenti területről. Tisztítás után a kaszatokat papírzacskóba tettük és felhasználásig a szabadban tároltuk.
A csírázási ritmus vizsgálata 2004. szeptember 7-én kezdődött és következő év szeptember 6-ig tartott. A kísérletek beállítása hetente történt. Petri-csészébe, nedves szűrőpapírra 4 x 100 magot tettünk, és állandó hőmérsékleten (20°C-on) termosztátban tartottuk. A kaszatokat sötétben csíráztattuk. Az értékelések a beállítást követő 14. napon történtek. Az eredményeket csírázási %-ban fejeztük ki a négy ismétlés átlagában.
A vizsgálatot tovább folytattuk, a begyűjtött kaszat mennyisége alapján, és eredményeinket kiszélesítettük megközelítőleg 3 éves adatsorra.
IV.1.1.3 Magkórtani vizsgálatok
A kaszatokat 2004. május hónapban gyűjtöttük Keszthelyen, útmenti területről. A gyűjtést követően a kaszatokat megtisztítottuk, papírzacskóba tettük és a felhasználásig a szabadban tároltuk. 2004.
szeptemberétől kezdtük el vizsgálni a Taraxacum officinale kaszatok éves csírázási ritmusát. Petri-csészében 100-100 kasztot, 4 ismétlésben csíráztattunk állandó (20°C) hőmérsékletre beállított termosztátban, sötétben. A csírázási % meghatározása a beállítást követő 14-ik napon történt.
A magkórtani vizsgálatok ezzel párhuzamosan folytak. A csírázási % meghatározását követően mikroszkopikus vizsgálatoknak vetettük alá a kaszatokat. A kaszatokon előforduló gombákról mikroszkopikus felvételeket készítettünk.
IV.1.1.4 Fény szerepe a kaszatok csírázásában
A kísérletet 2005. november 6-án állítottuk be két eltérő időpontban gyűjtött kaszat tétel felhasználásával.
2005. novemberben gyűjtött kaszatokat (közvetlen érés utáni állapotban), valamint a 2004. májusban gyűjtött, ez eddig a szabadban tárolt kaszatokat csíráztattunk sötétben (24 óra sötét), illetőleg természetes fényben, ablak mellett (10 óra megvilágítás, 14 óra sötét). A kísérletet laboratóriumi körülmények között, Petri-csészében állítottuk be, kezelésenként 4 ismétlésben, 100-100 kaszat felhasználásával. A fényben csíráztatott kaszatokat szobahőmérsékleten tároltuk, ablak mellett, természetes megvilágításban. A sötétben csíráztatott kaszatokat pedig termosztátban, állandó (20°C-os) hőmérsékleten, fekete vászonzacskóban becsavarva, 14 napon keresztül. Az értékelés a beállítást követő 14. napon történt.
IV.1.1.5 NaCl (sóstressz) vizsgálata a kaszatok csírázásában
A NaCl koncentráció (sóstressz) hatásának vizsgálata 2005. július 13-án indult. Azt megelőzően május hónapban kaszatokat gyűjtöttünk Nagykanizsán, útmenti területről. A kaszatokat megtisztítottuk, papírzacskóba tettük és a felhasználásig a szabadban tároltuk. A kísérletben különböző töménységű sóoldatokat használtunk, melyeket REDDY AND SINGH (1992) módszere alapján állítottunk össze: 0, 1, 10, 25, 50, 100, 200 és 400 mM. A 0 mM-os oldat a desztillált vizes kontrollnak felel meg. A kezeléseket 4 ismétlésben, 100-100 kaszattal végeztük, Petri-csészében és termosztátban állandó, 20°C-os hőmérsékleten, sötétben. Az értékelés a beállítást követő 14. napon történt.
IV.1.1.6 Ozmotikus potenciál (szárazságstressz) vizsgálata a kaszatok csírázásában
Az ozmotikus potenciál (szárazságstressz) vizsgálatot a sóstressz vizsgálattal egyidőben, azzal párhuzamosan végeztük. A kaszatok gyűjtésének helye, ideje, tárolásának módja a felhasználásig megegyezik a NaCl koncentráció vizsgálatoknál leírtakkal. A vizsgálatot Petri-csészében, termosztátban állandó hőmérsékleten, sötétben végeztük. A kezeléseket 4 ismétlésben 100-100 kaszattal állítottuk be, melyek értékelése a beállítást követő 14. napon történt. Az eredményt a négy kezelés átlagában, %-os formában adtuk meg. A kísérlet során PEG-6000-t (polietilén-glikol) alkalmaztunk Michel-Kaufmann (1973) valamint Sauerborn et al. (1988) által leírtak szerint. Kontrollként a kaszatokat desztillált vízben csíráztattuk.
A -1, -3, -5 és -10 bar ozmotikus potenciál eléréséhez az alábbi PEG-6000 koncentrációt mértük be:
3. táblázat: A kívánt ozmotikus potenciál eléréséhez felhasznált PEG mennyisége
Ozmotikus potenciál
[bar] PEG/kg H2O
-1 78
-3 151
-5 202
-10 296
IV.1.1.7 Allelopátiás vizsgálatok
2005. június hónapban Keszthelyen útmenti területekről gyűjtöttük a pongyola pitypang gyöktörzsét és levelét a növény virágzási fenológiai stádiumában.
2005. június 21.-én laboratóriumi körülmények között, Petri-csészében állítottunk be kísérletet. A Taraxacum officinale gyökereket és leveleket csapvizes mosást követően 1-1.5 cm nagyságúra vágtuk. Mixerben finomra daráltuk, majd BÉRES (1992) módszere alapján 200 ml vízbe, acetonba és 96 %-os etanolba bemértünk 50 illetve 100 g-t. Kezelésenként 4 ismétlést alkalmaztunk. 7 fűfaj (angolperje, franciaperje, csomós ebír, réti perje, vörös csenkesz, magyar rozsnok, sudár rozsnok) és 3 pillangós faj (szarvaskerep, fehér here, eper here) magvait kezeltük a pongyola pitypang gyökerének és levelének vizes, acetonos és etanolos kivonatával. A magokat a Pannon Egyetem Gyepgazdálkodási Tanszék Tangazdaságából kaptuk. A következő oldatokat használtuk fel a kísérlet során: 50 g levél 200 ml acetonban, 50 g levél 200 ml etanolban, 50 g gyökér 200 ml vízben, 50 g gyökér 200 ml acetonban, 100 g gyökér 200 ml acetonban és 100 g gyökér 200 ml etanolban.
Oldószerbe helyeztük a növényi részeket, és szobahőmérsékleten hagytuk állni 24 órát. Azt követően az alkoholos, acetonos és vizes oldatot szűrőpapíron leszűrtük, majd 10 cm átmérőjű Petri-csészébe öntöttünk 10-10 ml szűrletet. Az alkoholt és acetont hagytuk elpárologni, majd desztillált vízzel nedvesítettük a szűrőpapírt és ráhelyeztük a fűfajok és pillangósok magvait. Az allelopatikus hatást a magvak csírázási %-ban fejeztük ki, értékelés a fűfajok és pillangósok, szabványban (MSZ 6354/3) rögzített időpontjában, a beállítást követő 12, 14, 21 és 28-ik napon történt.
IV.1.1.8 Hőmérséklet hatása a kaszatok csírázására
A vizsgálatok 2006. november 8-án kezdődtek. Előzetesen, 2005. novemberében Keszthelyen, útmenti területről begyűjtött kaszatokat használtunk fel a kísérlet során. A vizsgálatot termosztátban és sötétben végeztük, természetesen különböző hőmérsékleti tartományokban. A vizsgálandó tartományok a következők voltak: 5-10-15-20 (kontroll)-25-30-35-40°C. A kezeléseket 4 ismétlésben végeztük, 100-100 kaszat beállításával, majd az értékeléseket %-os formában fejeztük ki a beállítást követő 14-ik és 21-ik nap után. A vizsgálat során nem csak a csírázási %-ot jegyeztük le, hanem az első csíra megjelenésének idejét (nap) is, mely befolyásolta az értékelések napjának maghatározását.
IV.1.1.9 Növekedési hormonok hatása a kaszatok csírázásában
A fitohormonok hatásának vizsgálatát 2007. július hónapban végeztük. 2006. június hónapban gyűjtött kaszatokat használtunk fel a vizsgálataink során, melyet Keszthelyen, útmenti területről gyűjtöttük. A gyűjtést követően megtisztítottuk őket, papírzacskóba helyeztük, majd a felhasználásig a szabadban tároltuk. A vizsgálat során felhasznált fitohormonok a következők voltak: indolil-vajsav (203,2 g/mol), 0,1-0,2-0,5-0,8%-os α-NES, valamint desztillált vizes kontrollkezelés. Kezelésenként 100-100 kaszatot csíráztattunk 5-6 ml előre elkészített oldatsorozatból. A csíráztatás termosztátban, állandó hőmérsékleten (20°C-on), sötétben zajlott, majd az értékelés %-os formában a beállítást követő 14-ik napon történt.
IV.1.2 Regenerálódás vizsgálat
IV.1.2.1 Regenerálódó képesség éves ritmusának vizsgálata
Laboratóriumi körülmények között 2005. november hónapban állítottunk be kísérletet. A gyökerek gyűjtése minden hónap elején történt elhagyott, művelés alatt nem álló területről, Nagykanizsa térségében. A gyökereket megtisztítottuk majd egyenlő nagyságúra (5-6 cm) félbevágtuk. Termosztátba helyeztük állandó, 20°C-ra, sötétbe. 4 ismétlésben dolgoztunk, az értékelés a beállítást követő 14-ik napon történt. Vizsgáltuk a gyökérnyakhoz közelebbi („A” szegmens) és távolabbi („B” szegmens) gyökérrészek regenerálódó képességét, melyet hajtásszámban és hajtáshosszban rögzítettünk.
IV.1.2.2 A Taraxacum officinale gyökerek regenerálódó képessége
Laboratóriumi körülmények között állítottuk be a kísérletet 2007. július hónapban. A gyökereket Keszthelyen gyűjtöttük, útmenti területről. A gyűjtést követően megtisztítottuk, majd osztályoztuk őket.
Azonos hosszúságú gyökerekre csoportosítottuk, majd a regenerálódás vizsgálatot ez alapján végeztük. A gyökereket feldaraboltuk eltérő hosszúságokra, melyek a következők voltak: 0,5-1-1,5-2-2,5-3-3,5-4 cm. A 2 cm-es szegmenseket 8-10-12-14 cm hosszú gyökerekből nyertük. Termosztátban, állandó 20°C-on, sötétben történt a regenerálódás. Az értékelés a beállítást követő 14-ik napon történt. Értékeléskor rögzítésre került a feldarabolt gyökérszegmensek hossza és átmérője, a keletkezett hajtások száma, hajtásonkénti levélszám és hajtáshossz.
IV.1.3 Tápelem felvétel vizsgálat
IV.1.3.1 NPK koncentráció tartalom éves ritmusának vizsgálata
Laboratóriumi körülmények között állítottuk be a kísérletet az éves regenerálódó képesség vizsgálattal párhuzamosan. A kísérlet azonos időpontban indult és tartott (12 hónap). A növényeket elhagyott területről gyűjtöttük be, Nagykanizsán. A mintákat szétválasztottuk (hajtás és gyökér), tisztítottuk, daraboltuk, szárítószekrényben 105°C-on súlyállandóságig szárítottuk, majd azokat papírzacskóba helyeztük a felhasználásig. A tárolás szobahőmérsékleten történt. Nitrogén (N) koncentrációt vizsgálatát Kjeldahl módszerrel, foszfort (P2O5) spektrofotométerrel, míg a kálium (K2O) tápelemét lángfotométerrel végeztük.
IV.1.4 Genetikai vizsgálatok
IV.1.4.1 A Keszthely térségi pongyola pitypang populáció polimorfizmus vizsgálata
Részben laboratóriumi részben pedig üvegházi körülmények között beállított kísérletünk során vizsgáltuk a pongyola pitypang rokonsági viszonyait. Változatai nagy számban fordulnak elő, így genetikailag végeztünk vizsgálatokat annak érdekében, hogy megállapíthassuk azok polimorfizmusát.
Vizsgálataink során nagyobb hányadát tekintve keszthelyi populációval dolgoztunk, azonban bevontunk még külföldi (japán, német, ausztriai) mintákat is.
A kaszatokat útmenti területről, Keszthely térségében, 2006. május hónapban gyűjtöttük. A gyűjtést követően tisztítottuk azokat, papírzacskóba tettük és a felhasználásig a szabadban tároltuk.
Effektív genetikai vizsgálatainkat csíráztatás és szikleveles állapot elérése előzte meg. Ennek érdekében 2007-ben üvegházi körülmények között az előzetesen begyűjtött és a felhasználásig szabadban tárolt kaszatokat tenyészedényekbe vetettük. A tenyészedények 10x10x10 cm3 nagyságúak voltak, melybe „B”
kategóriás virágföldet tettünk. A kaszatokat a felszín alá 1 cm-el vetettük, majd igény és az üvegházi hőmérsékleti tényezők szerint öntöztük. Célunk az első levél fejlettségi állapot elérése volt, mely szolgáltatja a későbbiekben kitűzött genetikai vizsgálat alapját és mintavételét.
DNS izolálása:
A genomiális DNS-t a Gentra Genomic DNA Purification Kit (Gentra Systems USA) használatával izoláltuk.
A kívánt fenológiai állapotot elért növényi mintákból (lomblevél) 10-30 mg (csipetnyi) szöveti részt lemetszettünk. A növényi szöveteket Eppendorf-csőbe tettük, melyre finom kvarchomokot szórtunk és üveglándzsával szétdörzsöltük. Az így finomra őrölt szöveti részhez hozzáadtunk 300 µl sejtbontó (Cell Lysis Solution) oldatot. 60 percen keresztül 65°C-on inkubáltuk. Az inkubációs idő leteltével hozzáadtunk 1,5 µl RN-áz „A” oldatot, jól és egyenletesen összekevertük az elegyet és további 60 percen keresztül 37°C-on inkubáltuk. Az inkubáció után 1 percre jég ágyra tettük, hogy szobahőmérsékletre hűljön. Ezt követően 100 µl fehérje (Protein Precipitation Solution) oldatot adtunk hozzá, melyet nagyon jól összekevertünk és centrifugába helyezve 16000-es fordulaton 10 percig centrifugáltuk. A kicsapódott fehérjét (zöld színű, az Eppendorf-cső alsó részén vált ki) nem megbolygatva lepipettáztuk a DNS-t tartalmazó oldatot, melyet ezt követően egy 1,5 ml-es csőbe injektáltunk. Hozzáadtunk 300 µl izopropanolt. A mintánkat jól összekevertük, ráztuk majd pedig 16000 fordulatszámon centrifugáltuk 1 percen keresztül. A felső oldatrészt leöntve a Eppendorf-csövet papírra téve felszárítottuk majd hozzá adtunk a tartalmához 300 µl 70%-os etanolt.
Szintén jól összeráztuk és 16000 fordulaton centrifugáltuk 1 percig. Az etanolt leöntöttük, majd a csöveket száradni hagytuk szobahőmérsékleten 5-10 percig. Ehhez adtunk 50 µl DNS (DNA Hydration Solution) oldatot és szobahőmérsékleten hagytuk állni 16-18 órát. Centrifugáltuk a mintánkat 16000-es fordulatszámon 5 percen keresztül. A DNS-t tartalmazó oldatot átpipettáztuk egy tiszta Eppendorf-csőbe, amely a későbbi PCR alapanyagát képezte. A PCR elvégzéséig a mintákat -20 és -80°C között tároltuk.
Próba PCR-t végeztünk, azonban a reakció nem működött, ebből a DNS oldat nem megfelelő tisztaságára következtettünk. A probléma megoldására CTAB utótisztítást alkalmaztunk.
CTAB utótisztítás:
CTAB oldat: 100 ml: 1 g CTAB, 5 ml 1M Tris-HCl, 2 ml 0,5 M EDTA
Az oldatunkhoz adtunk azonos mennyiségű CTAB (ketiltrimetilammónium-bromid) oldatot, jól összekevertük és 30 percre 65°C-on inkubáltuk. Ezt követően azonos mennyiségű izopropanollal kicsaptuk a DNS-t, majd 8000 rpm-en centrifugába tettük 5 percre, 4°C-ra. Az oldatot leöntöttük, majd a csapadékot mostuk 450 mikroliter 70%-os etanollal. Ismét lecentrifugáltuk, majd az oldat leöntése után 1 órát szárítottuk a mintákat, majd 100 mikroliter TE pufferben feloldottuk a DNS-t. Az utótisztítás után sikeresen alkalmaztuk a PCR-t.
A kloroplaszt és mitokondrium DNS fragmentumokat a következő primer párokkal (4. táblázat) szaporítottuk fel, melyeket DEMESURE ET AL.(1995) módszerei alapján választottunk ki:
· Kloroplaszt: 18S-5S, psbC2-trnS1
· Mitokondrium: nad5af-nad5r, nad4exon1-nad4exon2a
A PCR elegy 20 µl volt, mely a következő összetevőkből állt: 50ng DNS, 2 µl 10XPCR puffer (100 mM Tris-HCl, 15 mM MgCl2, 500 mM KCl, 0.1 % Triton X-100) oldat, 2 µl 2mM dNTP, 20 pikomol a primerekből és 0,8 unit DNS polimeráz enzim (DynaZyme DNA polymerase, Finnzymes, Finland). A PCR-t Robocycler (SPCR-traPCR-tagene, USA) műszerrel végezPCR-tük a kövePCR-tkező mePCR-todika szerinPCR-t: 94°C 3 percig, 35 ciklus 94°C-on, 58/60°C 1 percen, 72°C-on 2 percig majd végül pedig ismételten 72°C-on 10 percig.
A következő restrikciós enzimekkel dolgoztunk: Hae III, Hinf I, Msp I és Rsa I. Az emésztés 10 µl PCR termékben történt, melyhez 1 µl restrikciós enzimet adtunk. A mintákat 4 órán át 37°C-on inkubáltuk. Ez idő alatt végbement az emésztés. A restrikciós fragmentumokat 1,5%-os agaróz gélen (etidium bromid tartalmú) szétválasztottuk majd GeneGenius gél dokumentációs rendszerrel fotót készítettünk róla. A végső PCR termék méretét 100 bp-os (Fermentas, Lithuania) DNS-létrával határoztuk meg.
4. táblázat: A PCR során alkalmazott primer párok
Kloroplaszt primer Primer párok Kapcsolódási (annealing)
hőmérséklet
18S-5S 18S
5S 5’-GTGTTGCTGAGACATGCGCC-3’
5’-ATATGGCGCAAGACGATTCC-3’ 58°C
psbC2-trnS1 PsbC2
trnS1 5’-GGTCGTGACCAAGAAACCAC-3’
5’-GGTTCGAATCCCTCTCTCTC-3’ 60°C
Mitokondrium
primer Primer párok Kapcsolódási (annealing)
hőmérséklet
nad5af-nad5ar nad5af
nad5ar 5’-GAAATGTTTGATGCTTCTTGGG-3’
5’-ACCAACATTGGCATAAAAAAAGT-3’ 60°C
nad4exon1-nad4exon2a nad4exon1
nad4exon2a 5’-CAGTGGGTTGGTCTGGTATG-3’
5’-TCATATGGGCTACTGAGGAG-3’ 60°C
Ezen genetikai vizsgálatokat a Pannon Egyetem Georgikon Kar, Növénytudományi és Biotechnológiai Tanszék, Biotechnológiai Kutatócsoport genetikai laboratóriumában végeztük.