SLO kohorsz vizsgálat

A koleszterin és a 7-DHC szintek mérése során minden beteg esetében extrém emelkedett szérum 7-DHC szintet tudtunk mérni (20. táblázat). A koleszterin szintek általában alacsonyak voltak a betegek zömében, a korspecifikus referenciatartományhoz viszonyítva. A 13-ból 12 beteg esetében sikeresen állítottuk fel a molekuláris genetikai diagnózist (20. táblázat).

20. táblázat. A magyarországi SLO betegek klinikai, genetikai és biokémiai jellemzői. A Magyarországon jelenleg ismert 14 SLO-szindrómás betegből a táblázat a hazánkban diagnosztizált 13 adatait tartalmazza. Rövidítések: E (enyhe), T (típusos), S (súlyos). Korspecifikus referenciatartományok: 7-DHC: <0,15 mg/L, Koleszterin: 0–1 év:

>1,3, >1 év: 2,8–5,2 mmol/L. Módosítva az eredetiből (DOI: 10.1556/650.2015.30256).

Az ismert nonszensz, misszensz és splicing defektust okozó mutációk mellett egy korábban nem leírt misszensz mutációt, a c.374A>G (p.Tyr125Cys) mutációt mutattuk ki heterozigóta formában.

A mutáció patogenitását az alábbiak támasztják alá:

1. Az érintett aminosav reziduum filogenetikailag rendkívül konzervált (31. ábra) 2. A Grantham - differencia 194.

3. A SIFT alapján az érintett reziduum a tirozin-cisztein cserét nem tolerálja.

31. ábra. A Tyr125 (vastagon jelölve) filogenetikai konzervativizmusa. Forrás: DOI: 10.1159/000343923.

Mindezek mellett ez volt az egyetlen gyaníthatóan kóroki mutáció, amit in trans detektáltunk egy ismert másik SLO-t okozó mutációval, a c.976G>T (p.Val326Leu) mutációval az érintett betegben. A fehérje ezen részében írtak már le kóroki mutációkat (p.His119Leu (226), p.Gly138Val (530)). A c.374A>G mutáció esetében a PCR-RFLP analízis kizárta annak a valószínűségét, hogy ez egy ártalmatlan polimorfizmus lenne, amely jelen van a magyar populációban. 100 allélt reprezentáló 50 egészséges egyénben a mutáció nem volt kimutatható. Ez

az eltérés a gnomAD adatbázisban sem szerepel

(https://gnomad.broadinstitute.org/gene/ENSG00000172893?dataset=gnomad_r2_1, 2020. 04. 21-i keresés).

Az emelkedett 7-DHC specifikus SLO szindrómára (229), így a 13-as beteg esetében a diagnózis az emelkedett 7-DHC szint és a klinikai tünetek alapján felállítható volt annak ellenére, hogy csak egy patogén mutációt tudtunk kimutatni. Ebben az egyedi esetben egy rendkívül alapos három szintű genetikai analízist végeztünk el. Az első szintű a kódoló régió vizsgálata egy korábban leírt patogén mutációt mutatott ki (c.452G>A (p.Trp151*)). A második szintű genetikai tesztelésben a nem kódoló exonokat és a szabályzó régiókat vizsgáltuk meg, ez eredménytelen volt, a harmadik szinten pedig cDNS szekvenálást végeztünk a beteg mintájában, amely az alábbi konklúzióhoz vezetett. Nem volt kimutatható más mutáció, ami érintené a kódoló régiót, ami arra utal, hogy inkább az mRNS mennyisége, mint minősége érintett a másik, nem identifikált genetikai eltérés által. A DNS és RNS szinten, vizsgálataink bebizonyították a nonszensz mediálta mRNS lebomlás jelenlétét, hiszen a fehérvérsejtekből nyert mRNS-ben nem volt kimutatható p.Trp151* allél (32.

ábra).

32. ábra. A nonszensz-mediálta mRNS lebomlás (NMD) jelensége SLO-ban. A gDNS-ben jelen levő adenin (alsó panel) az mRNS-ből hiányzik (felső panel). Forrás: DOI: 10.1159/000343923.

A DHCR7 mutációk esetén mutattak már ki NMD jelenséget (461). Nem könnyű ezt a beteget elhelyezni az SLO spektrumában, fenotípusa enyhébb. Az összes exon és az exon-intron határok vizsgálata kb. 95%-os detektálási szenzitivitást jelent (531). Nem zárható ki annak a lehetősége, hogy valamilyen távoli szabályzó elemben bekövetkező mutáció csökkenti, de meg nem szünteti az mRNS keletkezését, hiszen a cDNS szekvenálás bizonyította a másik mutációt hordozó allél mRNS szintű expresszióját, mert a cDNS szekvenálás a p.Trp151* allél hiányát mutatta ki.

A földrajzi különbségek jelen vannak az SLO mutáció spektrumában is. Az irodalomban leírt leggyakoribb c.964-1G>C mutáció, amely valószínűleg brit eredetű (249) és gyakran kimutatható a Mediterráneumban (532), viszont szinte teljesen hiányzik a szláv eredetű népességből (532, 533)

a mi beteganyagunkban is a második leggyakoribbnak találtatott, négy allélen volt jelen. A mi kohorszunkban a p.Trp151* 6 esetben volt kimutatható, ami a leggyakoribb mutációvá tette ezt az eltérést. Összességében ez a mutáció úgy tűnik, hogy meglehetősen gyakran előfordul Lengyelországban, Ausztriában, Csehországban, Szlovákiában és igen ritka Nagy-Britanniában és Olaszországban. A másik tipikus kelet európai mutáció, a p.Val326Leu (249) nagyon hasonló eloszlási mintázatot mutat. Összességében ez azt mutatja, hogy az allél heterogenitás különbözik Európa különböző népeiben.

Egy család kivételével a patogén mutáció kombinációk nonszensz-misszensz, misszensz-misszensz vagy splicing-misszensz-misszensz mutációk, ami azt jelenti, hogy egyfajta reziduális enzim aktivitás ezekben az esetekben nem zárható ki. Egy nonszensz mutáció bizonyosan, míg egy splicing mutáció nagyon valószínűen teljes funkcióvesztést jelent, de egy misszensz mutáció esetében valamilyen fokú aktivitás megtartott maradhat. Az egyedüli eset, ahol kettő igazolt null allélt mutattunk ki (c.964-1G>C) az első érintett gyermek az első életnapon halt meg és a második és harmadik terhessége az édesanyának spontán vetéléssel végződött a 7. és 14. héten. A második magzatból molekuláris genetikai tesztelés nem történt, de a másik kettő esetében kimutattuk a c.964-1G>C mutációt. Összeségében ezek az eredmények arra utalnak, hogy a korábbi megfigyelések valószínűleg helytállóak, miszerint két súlyos null allélt eredményező mutáció nagyon ritka kivételtől eltekintve nem kompatibilis az élettel. Emellett azt is alátámasztjuk, hogy az érintett gyermekek fenotípusa nagy mértékben a genotípustól függ, de nem zárható ki egyéb genetikai és környezeti módosító tényezők fontos szerepe. Hasonlóan számos, rendkívül súlyos monogénes betegséghez, az SLO esetében is a klinikai laboratóriumi genetika célja a reprodukciós döntéshozatal segítése. Eddigi munkánk során öt család esetében kilenc alkalommal végeztünk prenatális genetikai diagnosztikát (hét esetben chorion biopszia, két esetben magzatvíz mintavétel). Két esetben detektáltunk kóros genotípust, míg a megszületett hét gyermek közül mind az öt vizsgált esetben egyezett a pre- és posztnatális molekuláris diagnosztika eredménye (négy gyermek heterozigóta hordozó, egy gyermek vad típus). A prenatális molekuláris diagnosztika esetén a minta laboratóriumba érkezése és az eredmény közti leletátfordulási idő átlagosan 2,55 nap (legrövidebb 1, leghosszabb 4 nap) volt.