Új misszensz mutáció detektálása dystrophinopathiában

4.5.1. Genetikai analízis

Az MLPA-val végzett deléció/duplikáció analízis a beteg mintájában a DMD gén 4-es exonjának teljes (hemizigóta) hiányát írta le. A 4-es exonra specifikus primerekkel végzett PCR amplifikáció azonban a 4-es exon delécióját nem támasztotta alá, arra utalva, hogy az MLPA eredmény fals pozitív. A 4-es exon Sanger szekvenálása egy új hemizigóta pontmutációt írt le (c.227A>T, p.Asn76Ile). Az édesanya célzott genomiális DNS analízise a mutáció de novo voltát igazolta.

Annak igazolására, hogy más patogén mutáció nincsen a DMD génben, a teljes kódoló régiót megszekvenáltuk. Az adatelemzés a promóter, a exoni régiók és az exon/intron határtól +/−5 nukleotidra levő régiók vizsgálatára korlátozódott és három hemizigóta variánst mutatott ki. A fenti c.227A>T mutáción kívül két sokkal gyakoribb eltérést sikerült kimutatnunk, mindkettőt hemizigóta formában (13. táblázat).

13. táblázat. A DMD gén szekvenálásának eredménye. Referencia szekvenciák: LRG_199t1 (DNS), LRG_199p1 (fehérje). MAF: minor allél frekvencia (1000 Genom Projekt).

A c.227A>T mutációt az LOVD (Leiden Open Variation Database) adatbázisba feltöltöttük (ID:

00105210).

4.5.2. Izom hisztológia, dystrophin immunhisztokémia

Az izombiopszia enyhe dystrophiás jeleket írt le (23. ábra). A dystrophin expresszió az egyes antitesttel változó intenzitásúnak adódott, sarcolemmális jelölődéssel, szegmentálisan súlyosan csökkent vagy hiányzó jellel, a kettes antitesttel intenzív lineáris sarcolemmális expressziót, normál mintázatot mutatott, míg a hármas antitesttel az izomrostok zöme negatív volt, néhány revertáns rost volt kimutatható teljes vagy szegmentális sarcolemmális expresszióval (23. ábra B, C, D). A spektrin immunohisztokémia normál lineáris sarcolemmális expressziót mutatott (23.

ábra E). Az α, β, γ és δ sarcoglycan lineáris sarcolemmális expressziót közepes vagy magas

intenzitással, néha csökkent expressziós szinttel mutatott. A merosin erős lineáris sarcolemmális expressziót mutatott (23. ábra F).

23. ábra. Izom biopszia vizsgálata. Ábramagyarázat a szövegben. Forrás: https://doi.org/10.1016/j.nmd.2017.12.003.

Dr. Hortobágyi Tibor felvételei.

4.5.3. A p.Asn76Ile mutáció hatásának in silico vizsgálata

A kristályszerkezet alapján a 76Asn reziduum az N-ABD aktin kötő doménben van, a CH1 szubdoménben az E hélixben (24. ábra A). Jelenlegi ismereteink szerint az Asn76 az aktin kötőhelynek nem része, közvetlenül az aktinhoz nem kötődik (488). Az Asn76 oldallánca nem a CH1 szubdomén felszíne felé néz, sokkal inkább a C és E hélixek és a D loop közt van elrejtve.

Az oldallánc atomok a 76-os aszparaginnál hidrogén kötési távolságban vannak az Asp46 és Glu65 fő lánc atomjaival. Ezek a hidrogén hidak elképzelhető, hogy stabilizáló interakciókat jelentenek a CH1 szubdoménben, amely lehetővé teszi az E hélix (Asn76) a B loop (Asp46) és a D loop közti kapcsolat kialakítását (24. ábra A). A humán dystrophin szekvencia összehasonlítása az utrophin, α-actinin 3 és fimbrin szekvenciájával az N-ABD domének esetében az Asn76 reziduum nagyfokú konzerváltságát mutatja (24. ábra C) összhangban a korábbi analízisekkel (488, 505, 506).

A másodlagos szerkezet predikció nem utal az E hélix sérülésére; a mutáns fehérje fenntartja a

konzervált hidrogén hídját, amely az Asn76 és az Asp46 valamint a Glu65 között van, nagy valószínűséggel elveszíti azáltal, hogy a poláros aszparagin reziduum hidrofób izoleucinná változik. Ez a mutáció a predikció alapján rendkívül destabilizáló (ΔΔG > 3 kcal/mol), ami fehérje funkció sérülést jelezhet. A mutáns fehérje aggregációs hajlama nem tűnik fokozottnak, hiszen az érintett pozíció az aggregációra hajlamos régióktól távol esik.

24. ábra. A humán dystrophin, utrophin, α-actinin 3 és fimbrin szerkezete és szekvenciája. A) A dystrophin aktin kötő doménje. B) A konzervált aszparagin aminosavak interakciói utrophin, α-actinin 3 és fimbrin esetén. C) Az aktin kötő domének szerkezet-alapú szekvencia összehasonlítása. Az Asp46, Glu65 és Asn76 reziduumok zöld

színnel jelölve. Forrás: https://doi.org/10.1016/j.nmd.2017.12.003. Dr. Mótyán János munkája.

A 14 hónapos kisfiúnál tapasztalt enyhe hypotónia és a motoros fejlődés késése valamint a nagyon emelkedett CK aktivitás BMD/DMD gyanút vetett fel. A molekuláris genetikai analízis igazolta a dystrophinopathiát, mindössze egy kórokinak tűnő misszensz variáns detektálásával. Fontos megemlíteni azt, hogy az MLPA teszt fals pozitív eredményt adott, hiszen a mutáció pontosan a hibrizáló próba alatt fekszik, ezáltal a próba amplifikáció előfeltétele, a ligálás nem jöhet létre a két, megfelelően hibridizált próba hiányában. A gyártói előirat, miszerint az egy exont érintő deléciót/duplikációt mindenképpen független módszerrel meg kell erősíteni, itt rendkívül nagy jelentőséget nyert, hiszen egy nem megerősített eredméy hemizigóta deléciót írna le, holott itt

pontmutációról van szó. A variánst valószínűen patogénnek minősítjük (507) a következő tények miatt:

1. A variáns de novo voltát igazoltuk

2. A nagy, populációs szintű adatbázisokban a mutáció nincs jelen (ExAC, 1000 genom projekt) 3. Az érintett aminosav evolúciós konzerváltsága és a beteg fenotípusa specifikus az egy genetikai etiológiával leírható betegségre.

A dystrophinopathia gyanúját felveti a magas CK aktivitás és a klinikai kép. Az izombiopszia is enyhe myopathiás változásokat mutatott ki, és a dystrophin expressziós mintázata egyértelműen kóros volt, a dystrophin nagymértékben csökkent és szegmentálisan hiányzó festődést mutatott a core régióban, és teljesen csökkent vagy nagyon erősen csökkent festődést mutatott az N-terminálison. Ezek az eredmények egybehangzóak a genetikai analízis eredményével is. A misszensz mutációk ritkák a Duchenne/Becker izomsorvadásban, de nagy részük pontosan az N-ABD dystrophin domént érinti (89, 508). Az Asn76 evolúciósan (24. ábra C) és struktúrálisan is (24. ábra B) konzervált. Másodlagos szerkezetbeli változást nem sikerült kimutatnunk, de a stabilitás vizsgálat a mutáció nagyfokú destabilizáló hatását írja le, mely hatását valószínűleg egy lokális konformáció változáson - amelynek a stabilizáló interakciók elmaradása lesz az oka - keresztül fejti ki. Ebben az esetben a klinikai genetika egyik legfontosabb feladatát, a fenotípust illető hosszútávú előrejelzést igen nehéz adni, hiszen egy korábban le nem írt misszensz mutáció rendkívül korai detektálása bőven a Duchenne/Becker izomsorvadás klasszikus klinikai tüneteinek jelentkezése előtt, a még most is csak 4 éves a gyermek esetében történt. Az in silico analízis sejteti a patogenitást, de nem tud információt adni a betegség súlyosságára nézve. Összességében véleményünk szerint ez a mutáció Becker izomsorvadáshoz vezet, de a klinikai fenotípust újra és újra vizsgálni kell. Mivel a mutáció de novo és a de novo mutációk esetében a genetikai tanácsadás 2%-os ismétlődési kockázatot ír le, ezt fontos figyelembe venni a tanácsadás folyamata során (509). A genetikai tesztelés szempontjából fontos tanulsága ennek az anyagnak az, hogy az egy exont érintő strukturális változásokat, amelyeket MLPA-val detektálunk, más független módszerrel meg kell erősíteni. Megjegyzendő továbbá, hogy egy detektált eltérés funkcionális következményének vizsgálata milyen sokféle módon lehetséges, beleértve az immunhisztokémiát és a különböző in silico módszereket is. A genetikai vizsgálatokat Dr. Koczok Katalin PhD hallgatóm, míg a beteg klinikai menedzsmentjét Dr. Merő Gabriella (Jósa András Megyei kórház, Nyíregyháza) végezte.