A klinikai laboratóriumi genetikának ritkán adatik meg, hogy előregyártott, optimalizált, CE-IVD eszközökkel dolgozzon a diagnosztikai eljárás során. Ennek következménye a számos módszertani fejlesztés, optimalizáció, melyek nagy része a specifikus diagnosztikai esetek/kohorszok fejezetekben kerül bemutatásra. Itt azt a két esetet mutatom be, amely általános jelentőséggel bír, hiszen minden, a területen végzett diagnosztikai eljárás során van szerepe. Az egyik módszertani fejlesztés az anyai kontamináció vizsgálata prenatális mintavételt követően, a másik pedig a piroszekvenálás analitikai teljesítőképességének analízise, különös tekintettel a homopolimer szakaszok vizsgálatára.
1.2.1. Az anyai sejt kontamináció hatása a molekuláris genetikai diagnosztikai tesztekre invazív mintavételt követő prenatális diagnosztika során
A non-invazív technikák döbbenetes térnyerése ellenére a prenatális diagnosztika fő terepe jelenleg még mindig az invazív prenatális diagnosztika. Annak ellenére így van, hogy a sejtmentes szabadon keringő DNS analízis felhasználási területe egyre bővül (170), elsősorban az anyai vérben kimutatható magzati DNS esetében a triszómiák vizsgálatára, de kezdenek ezek a tesztek
monogénes eltérésekre is választ adni. Mindenesetre az anyai sejt kontamináció az invazív beavatkozással nyerhető, a chorion biopszia (chorionic villus sampling, CVS) és a magzatvíz mintákban kimutatható és mind a két esetben súlyos preanalitikai kockázati tényezőt jelent (171).
A prenatális diagnosztika során végzett genetikai tesztelés minősége nagymértékben függ az anyai kontaminációtól, hiszen a nem egyértelmű eredmények legnagyobb része vagy anyai sejt kontaminációból (maternal cell contamination, MCC), vagy a nem megfelelően kezelt DNS minták degradációjából adódik (172). Az anyai sejt kontamináció a rossz diagnózis vagy nem informatív eredmények 0,1-3,8%-áért felelős (173). Az anyai sejt kontamináció rossz diagnózishoz vezethet tragikus terhességi következményekkel, valamint nem konkluzív eredményre, utóbbi miatt szükség lehet egy megismételt invazív beavatkozásra.
Amniocentézis során a mintába kerülő anyai vér okozza az amnion folyadékban az anyai sejt kontaminációt, habár önmagában a vér jelenléte nem jelent anyai sejt kontaminációt, mert az lehet magzati eredetű is (174). Tenyésztés során megtörténik a magzati sejtek pozitív szelekciója, azaz azok növekszenek és elvesznek az anyai kontamináló sejtek a sejttenyésztés alatt (175).
A chorion biopszia a külső cytotrophoblast és a belső mesoderm rétegek mintavételét jelenti. A mesodermális réteg egy későbbi magzati sejtvonalból származik, míg a cytotrophoblast egy sokkal korábbi vonalból, ebből következően kevésbé reprezentálja a magzati szöveteket (174). Az e sejtekből izolált DNS mind a cytotrophoblast, mind a mesenchymális eredetű sejteket tartalmazza (176). A direkt chorionboholy mintavétel csak a cytotrophoblast vonalat vizsgálja, míg a sejttenyésztés elsősorban a mesodermális sejtvonalat, így az ebből megállapított kariotípus sokkal inkább a magzatnak megfelelő (174). Az amnion folyadékhoz képest a CVS magasabb anyai sejtkontaminációs kockázattal bír, mert az anyai deciduát a magzati sejtekről eltávolítani teljes mértékben lényegesen nehezebb (177), a tenyésztett mintaanyag méginkább ki van téve kontaminációs veszélynek. Az anyai sejtkontamináció mértéke csökkenthető az anyai decidua chorion sejtekről történő pontos eltávolításával a sejttenyésztés megkezdése előtt (178).
Az anyai sejt kontaminációt először 1976-ban mutatták ki, mint a genetikai diagnózist alapvetően zavaró tényezőt (179). Régóta ismert az is, hogy ha az amnion folyadék első néhány milliliterét kiöntik, az anyai kontamináció 2,5-szer alacsonyabb lesz (180). Az anyai sejt kontamináció igen nagy szórást mutathat: 0,1 és 21,4% közötti arányok ismertek (181). Jelenleg az alacsony szintű mozaicizmus analíziséhez hasonlóan az anyai sejtkontamináció vizsgálatára is ugyanaz a módszer használatos, mégpedig a rövid ismétlődő DNS szakaszok amplifikációja (short tandem repeat, STR-PCR), mely módszer használata mind direkt mintában, mind pedig tenyésztett sejtvonalakon javasolt (181, 182). Az anyai sejtkontamináció 0,2% és 2,8% között szór tenyészett sejtvonalak
esetén (175, 183) és 0,1% - 21,4% között nem tenyésztett direkt mintákban (173, 183). Minden laboratóriumnak meg kell határozni az érzékenységi szintet, ameddig képes kimutatni a releváns anyai kontaminációs szennyezettséget.
Egy kínai tanulmány adatai szerint, ahol 387 invazív prenatális teszt eredményét dolgozták fel, összesen öt (1,3%) minta esetében mutattak ki anyai sejt kontaminációt, ahol kettő amnion folyadékból, három pedig chorion biopsziából származó minta volt (177). Ugyanez a publikáció felhívja a figyelmet arra, hogy az anyai sejt jelenléte az amnion folyadékban egyáltalán nem feltétlenül vezet diagnosztikus hibához, mert az több tényező függvénye: mi az adott genetikai betegség, mi az öröklődésmenet, mi az apai és az anyai mutáció. Összességében az anyai kontamináció miatti eredménytelenséget óvatosan kell kezelni, hiszen minden ilyen esetben az alapvető cél a tiszta egyértelmű genetikai diagnózison túl az invazív beavatkozás ismétlődésének elkerülése. Nagy jelentősége van a prenatális mintavételt végző tapasztalatának is: 1384 eset vizsgálatakor azt találták, hogy azon orvosok esetében, akik évente kevesebb, mint 50 amniocentézist végeznek a magzat vesztés aránya 14 napon belül 1:57, míg azok esetében akik több mint 50-et végeznek, ott majdnem egy nagyságrenddel alacsonyabb, 1:415 (184). 30 napon belül ugyanez az adat az 50 beavatkozásnál kevesebbet végző orvosok esetében 1:38, míg az 50 beavatkozásnál többet végző orvosok esetén 1:312. Az elfogadott ajánlás alapján, minden egyes prenatális diagnosztika esetében a molekuláris diagnosztikai teszt elvégzésekor függetlenül attól, hogy milyen öröklődésmenet és milyen betegségről van szó, ajánlott anyai sejt kontaminációs vizsgálatot végezni (182). Az ajánlás szerint a legalacsonyabb érzékenységi szint az 5%, azaz ekkora mértékű anyai sejt kontaminációt ki kell tudni mutatni. Az ajánlás azt is megfogalmazza, hogy az adott genetikai laboratóriumnak tisztában kell lenni a rutin módon alkalmazott diagnosztikai tesztek anyai sejt kontaminációra vonatkozó szenzitivitásával, mely szükséges a teszt eredméyének korrekt interpretációjához, azonban ennek a kialakítása nagyon nehéz. A szignifikáns anyai sejt kontamináció az eredmény interpretációját egyértelműen befolyásolja és nagy mértékben függ az alkalmazott módszertől, bár nem feltétlenül jelenti a teszt elvetését, sokkal inkább csak a megfelelő interpretációját: egy korai vizsgálat (185) multiplex PCR esetén (Duchenne izomsorvadás vizsgálatára) azt találta, hogy 5%-os anyai sejt kontamináció még tolerálható volt a megfelelő kísérleti körülmények betartásával. Egy másik analízis azt mutatta, hogy magasabb mint 20%-os anyai sejt kontamináció volt az, ami valóban zavaró tényező volt (microarray analízis) (186). E tanulmány szerint az anyai sejt kontamináció akár a magzati minták 7,1%-ban is jelen lehet, ennek megfelelően nagyon fontos a rutin módon használt diagnosztikai eljárás szenzitivitásának meghatározása (186).
Fentiekből az alábbi következtetéseket vontam le:
(1) az anyai kontamináció, annak minden, interpretatív és klinikai döntéshozatali következményével egy komoly diagnosztikai probléma,
(2) az ország egyik legnagyobb klinikai laboratóriumi genetikai diagnosztikai laboratóriumának, mely évente több tucat prenatális diagnosztikát végez monogénes betegségek területén, foglalkoznia kell az általa használt módszerek esetén a szignifikáns MCC módszerenkénti meghatározásával,
(3) számos modern módszer esetén (MLPA, új generációs DNS szekvenálás) a nemzetközi adatok is rendkívül hiányosak. Mindezek miatt döntöttem úgy, hogy egy szisztematikus kísérletsorozat keretében megvizsgáljuk a Sanger szekvenálás, az MLPA teszt és egy új generációs DNS szekvenálási módszer, a piroszekvenálás MCC érzékenységét.
1.2.2. Piroszekvenálási alapú új generációs DNS szekvenálási rendszer analitikai paramétereinek vizsgálata
A homopolimer (HP) egy olyan szekvencia mintázat, amely azonos nukleotid bázisokból áll. A majdnem minden exonban előforduló HP szekvenciák a rekombinációban illetve a transzkripció szabályozásában játszanak szerepet (187, 188). Legnagyobb részük (97%) 4-6 nukleotid hosszú.
A HP szekvenciák rendkívül mutagének és a hossz változással járó mutációk forró pontjának tekinthetők (189-191). A napjaink klinikai laboratóriumi genetikai diagnosztikájában használt új generációs szekvenálási technológiák esetében néhány nem képes a homopolimereket megfelelően szekvenálni a szekvenálás alapelve miatt. A piroszekvenálás (192) és az ion félvezető szekvenálás (193) esetében a jel - ami emittált fény vagy hidrogén ionok - erőssége attól függ, hogy hány azonos nukleotid bázis épül be a DNS szálba egy adott dNTP ciklus során. Azonban az induló linearitás a HP mintázatokban egyre inkább ellaposodik, ebből következően számos, mind túl sok, mind túl kevés nukleotid olvasásban megvalósuló hiba következhet be (194-196). Ami ezt különösen problémássá teszi, hogy a HP szekvenciák az inzerció és deléció mutációk forró pontjaiként szerepelnek, ezért ezeknek a kémiáknak a klinikai laboratóriumi genetikai diagnosztikai felhasználása a HP szekvenciák tekintetében rendkívül kérdéses (197). Számos bioinformatikai javító eszközt fejlesztettek ki, amelyek segíthetnek a HP szekvenciák megítélésében (198-203) viszont az adott új generációs DNS szekvenálási rendszer analitikai képességeinek meghatározása a rutin diagnosztikába történő beillesztés előtt elengedhetetlen (204). Érdekes módon nagyon kevés experimentális adat áll rendelkezésünkre arra nézve, hogy
mennyi az a pontos HP nukleotid szám, ahol a piroszekvenálás pontatlanná válik, ezért két tesztrendszert alakítottunk ki az általunk használt piroszekvenáláson alapuló új generációs szekvenálási rendszer analitikai képességének a vizsgálatára:
(1) plazmid vektorokban különböző homopolimereket hoztunk létre és ezeket szekvenáltuk új generációs szekvenálással,
(2) a CFTR gént vizsgáltuk egy saját fejlesztésű piroszekvenálási tesztrendszerrel ismert szekvenciájú betegmintákon.
A CFTR gén esetében a 27 exonból 17 tartalmaz 24 homopolimer szekvenciát. Ami különösen fontossá tette ezt, hogy a 14-es exonban a 7 adenint tartalmazó HP régió a c2046_2052, kifejezett mutációs forró pontként működik hiszen ez a poli-A szekvencia az alábbi patogén mutációkat is tartalmazhatja az irodalmi adatok szerint: c.2051_2052delAAinsG (2183delAAinsG) amely 5 adenint eredményez, míg a c.2052delA (2184delA) 6 adenint eredményez homopolimert, míg a hazánkban meglehetősen gyakori c.2052_2053 insA (2184insA) egy 8 adenin hosszúságú HP szekvenciát eredményez.