3. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK
3.1. PHS enzimmodellek
3.1.1. A PHS enzim m ű ködési modelljei TEMPO szabadgyökkel
A fenoxazinon-szintetáz enzim modellezéséhez használt legáltalánosabb vegyület a 2-amino-fenol (OAP) (3). Ez TEMPO jelenlétében már szobahőmérsékleten is reagál molekuláris oxigénnel 2-amino-3H-fenoxazin-3-on (APX) (6) keletkezése mellett. A szerkezetileg hasonló fenazinszármazékok reakciómechanizmusa feltételezéseink szerint hasonló, így azok vizsgálatát az előbbivel párhuzamosan szándékozunk bemutatni. Az o-fenilén-diamin (PDA) (13) csak 50°C-on vihető hasonló reakcióba megfelelő hozammal, 2,3-diamino-fenazin (DAP) (14) termék keletkezése mellett. A reakciókról elmondható, hogy szelektívek, az APX és DAP mellett más termékek jelenléte nem volt kimutatható. A keletkezett termékek koncentrációját UV-Vis spektroszkópiai, míg a felhasznált dioxigén mennyiségét gázvolumetrikus módszerrel (részletek: 4. fejezetben), a dioxigén-felvétel mérésén keresztül határoztuk meg. A reakciók sztöchiometriája a (9-10) egyenletek szerint írható le.
(9)
37
A keletkező 2-amino-3H-fenoxazin-3-on-t (6) a betöményített reakcióelegyből, éterrel való „kicsapással” kaptuk, valamint olvadáspontja (254-256°C) és UV-Vis spektruma alapján azonosítottuk. A 2,3-diamino-fenazint (4) preparatív VRK módszerrel nyertük ki, benzol-aceton (1 : 1) eluens alkalmazása mellett, majd szintén jellegzetes UV-Vis spektruma alapján azonosítottuk.
A reakciók sztöchiometriájának meghatározása után az oxidáció mechanizmusának tisztázása céljából részletes kinetikai vizsgálatokat végeztünk metanolban 25-50°C (OAP esetén) és 35-50°C (DAP esetén) tartományban. A reakciók időbeli lefutásának nyomon követésére az UV-Vis spektroszkópiai módszert alkalmaztuk. A termékek aktuális koncentrációját a Lambert-Beer-törvény alapján határoztuk meg. A mérési hullámhosszokban kicsi eltérés volt. Az APX termék abszorpciója metanolban λ = 435 nm (log ε = 4,20) volt, míg a DAP jellegzetes fényelnyelése λ = 430 nm, log ε = 4,22 abszorpciós koefficienssel. A kísérleteket 40 cm3 metanolban végeztük, a további körülmények pedig a 3-4. táblázatokban találhatóak.
3. táblázat. A 2-amino-fenol TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakciójának reakciókinetikai adatai
38
4. táblázat. A fenilén-diamin TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakciójának reakciókinetikai adatai
A 23. ábrán a 2-amino-fenol oxidatív kapcsolási reakciójában keletkező 2-amino-3H-fenoxazin-3-on termékhez rendelhető abszorpciós sáv időbeli változása látható. A spektrum jól reprezentációja a kísérleti megfigyeléseknek.
23. ábra
Az OAP TEMPO-katalizált reakciójának időbeli lefutása (3. táblázat, 13. mérés) A 2-amino-fenol és az o-fenilén-diamin TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakciói rendre a következő általános sebességi egyenletekkel írhatóak fel (11-12):
-d[OAP]/dt = d 0,5[APX]/dt = k [OAP]m [TEMPO]n [O2]q (11) -d[PDA]/dt = d 0,5[DAP]/dt = k [PDA]m [TEMPO]n [O2]q (12)
39
Annak érdekében, hogy az egyes reaktánsok részrendjét meghatározzuk, a reakciókat különböző szubsztrátum és katalizátor koncentrációk mellett, illetve levegőn is elvégeztük. A kísérletek leegyszerűsítése érdekében látszólagos elsőrendű körülményeket teremtettünk, ami azt jelenti, hogy az egyes részrendek meghatározása során a másik reaktáns koncentrációját állandó értéken tartottuk. Feltételezve, hogy a katalizátor (TEMPO) és a dioxigén koncentrációja az egyes reakciók előrehaladtával nem változik, a sebességi egyenlet a következő formára egyszerűsödik mindkét reakciósorozat esetén (szubsztrátum = OAP = PDA):
-d[OAP]/dt = k’ [OAP]m (13)
ahol k’ = k [TEMPO]n [O2]q (14)
A szubsztrátum részrendjének meghatározása a 24. ábrán látható, amelyen az OAP és PDA átalakulásának a sebességét a kiindulási koncentrációjuk függvényében ábrázolva megállapíthattuk, hogy a pontokra origóból induló egyenes illeszthető (R = 99,78 %, és R
= 98,42 %), tehát azok részrendje egy, m = 1.
24. ábra
Az OAP és PDA átalakulásának sebessége a kiindulási koncentrációjuk függvényében A katalizátor részrendjének megállapítása céljából, állandó szubsztrátum és dioxigén koncentráció mellett változtattuk a TEMPO kiindulási koncentrációját. Az észlelt reakciósebességi állandókat (k’) a TEMPO kiindulási koncentrációjának függvényében ábrázolva a 25. ábrán látható egyenesekhez (R = 99,85 % és R = 97,61 %) jutottunk, amely alapján elmondható, hogy a TEMPO részrendje is egy, tehát n = 1.
40 25. ábra
Az OAP (balra) és PDA (jobbra) TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakcióinak észlelt sebesség (k’) értékei különböző TEMPO kiindulási koncentrációk függvényében
A vizsgált reakciókat levegőn elvégezve (3-4. táblázat, 9. mérés) a számolt sebességi értékek alapján elmondható, hogy a reakciók sebessége független a dioxigén koncentrációjától, ami azt jelzi, hogy a dioxigénre vonatkozó részrend nulla. Állításunk alátámasztása céljából a reakció időbeli lefutását gázvolumetrikus módszerrel is nyomon követtük a dioxigén-felvétel mérésén keresztül. Eredményként a 26. ábrán feltüntetett egyeneshez jutottunk, amely egyértelműen jelzi, hogy a reakció dioxigénre nézve nulladrendű, tehát q = 0. A PDA reakciók során ugyanezeket tapasztaltuk.
26. ábra
A 2-amino-fenol TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakciójában észlelt dioxigén-felvétel [OAP]0 = [TEMPO]0 = 3,50 × 10-2 M; T = 323 K
A kinetikai mérések eredményei alapján elmondható, hogy a 2-amino-fenol és o-fenilén-diamin TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakciója bimolekulás sebességi
41
egyenletekkel írható le, amelyben a szubsztrátum és a TEMPO koncentrációja egyes hatványon szerepel. A reakciósebességi egyenletből számolt reakciósebességi állandó értéke OAP kísérleteknél 298 K-en k = (1,49 ± 0,02) × 10-4 mól-1 dm3 s-1-nek, PDA esetén 323 K-en k = (3,60 ± 0,13) × 10-6 mól-1 dm3 s-1-nek adódott. A sebességi állandó átlagának számítása: k = (∑iwiki/∑iwi). A 25. ábrán látható egyenesek meredeksége jó közelítéssel szintén ezeket az értékeket adja, vagyis a gyakorlati adatok alátámasztják az elméleti számolásokat.
A két reakciósorozatot azonos hőmérsékleten összehasonlítva a 2-amino-fenol oxidációja során kapott érték 323 K-en k = (2,47 ± 0,13) × 10-4 mól-1 dm3 s-1, vagyis az utóbbi nagyságrendekkel nagyobb. A különbség oka az O–H és N–H kötések erősségében keresendő.
Az irodalomból ismeretes, hogy a 2-amino-fenol acetonitrilben, levegőn 2-amino-fenoxazin-3-on-ná alakul át lassú autooxidációs reakció eredményeként [114]. A reakciókinetikai mérések eredményeként a szerzők egy bimolekulás sebességi egyenlethez jutottak (-d[OAP]/dt = kaut [OAP] [O2]), amelyből a reakciósebességi állandó értéke szobahőmérsékleten kaut = (1,46 ± 0,03) × 10-8 mól-1 dm3 s-1-nek adódott. Az autooxidációs reakcióra kapott értéket összevetve az általunk vizsgált rendszerre kapott értékkel, elmondható, hogy a TEMPO-katalizált reakció nagyságrendekkel nagyobb sebességgel játszódik le. A különbség a sebesség-meghatározó lépésben történő H• absztrakcióval magyarázható, amit a katalizátor jelentősen elősegít.
Különböző hőmérsékleten meghatározva a reakciósebességi állandókat, az Arrhenius (27. ábra) és Eyring (28. ábra) összefüggések lineárisnak adódtak, jelezve, hogy a reakciók a vizsgált hőmérséklettartományban azonos mechanizmus szerint játszódnak le.
A fenti összefüggésekből számolt aktiválási paraméterek a következők az OAP rendszer esetén:
EA = 17 ± 0,5 kJ mól-1,
∆H‡ = 15 ± 0,3 kJ mól-1,
∆S‡ = -268 ± 0,3 J mól-1 K-1.
42 A PDA rendszer esetén:
EA = 76 ± 11 kJ mól-1,
∆H‡ = 74 ± 10 kJ mól-1,
∆S‡ = -122 ± 31 J mól-1 K-1.
27. ábra
Az OAP (balra) és PDA (jobbra) TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakcióinak Arrhenius diagramjai
28. ábra.
Az OAP (balra) és (jobbra) PDA TEMPO-katalizált oxidatív kapcsolási reakciójának Eyring diagramjai
Az Arrhenius diagramról az egyenesek meredekségének értéke –EA/R -rel egyenlő, ahol R az egyetemes gázállandó (8,314 J K-1 mól-1) EA pedig az aktiválási energia. Az Eyring diagramról az aktiválási entalpia és entrópia értékeket lehet meghatározni, mégpedig az elsőt a meredekség alapján, ami –∆H‡/R -rel egyenlő. Az ordináta metszet
43 méréseket kiértékelve, az aktiválási paraméterek figyelembevételével, a reakciókra javasolt mechanizmus a (15-18) egyenletek alapján foglalható össze. A megállapítások a PDA rendszerre is igazak a megfelelő behelyettesítéssel.
(15)
(16)
(17)
(18)
Feltételezésünk szerint TEMPO jelenlétében a szubsztrátum hidroxilcsoportja és a gyök oxigénje között hidrogénhíd kötésen keresztül, egyensúlyi folyamatban egy molekulakomplex 15 jön létre (K1). A reakció leglassúbb, úgynevezett sebesség-meghatározó lépése a hidrogénatom átmenete a szubsztrátumról a gyökre, amely eredményeként 2-amino-fenoxil gyökhöz (16) jutunk. Az entrópia nagy negatív értéke összhangban van a javasolt bimolekulás sebességi egyenlettel. Ezt követően az o-benzokinon-monoimin (17) képződése kétféle úton vezethető le: a 2-amino-fenoxil gyök és a TEMPO gyök-gyök reakciójával, illetve a 2-amino-fenoxil gyök diszproporcionálódásán keresztül, amelyek gyors folyamatok. A képződő o-benzokinon-monoimin stabilitása kicsi, így gyors folyamatban kétszer két elektron oxidációs lépésben tovább alakul a termékké, 2-amino-fenoxazin-3-on-ná (6) az irodalomban leírt lépéseken keresztül [6, 11].
A javasolt mechanizmus alapján (feltételezve, hogy k1 << k-1, k2) a 15 átmeneti termék keletkezését és továbbreagálását a (19-20) egyenletek fejezik ki:
44
NH N
N N N
MnII(ClO4)2 6 H2O +
CH3CN NEt3,Ar
[Mn(6'-MeIndH)(H2O)2(CH3CN)](ClO4)2
18 19
d[15]/dt = k1 [OAP][TEMPO] (19)
- d[15]/dt = k-1 [15] + k2 [15] (20)
A stacioner állapot elve alapján (felhasználva, hogy Σ[OAP] = [OAP] + [15]) a (19) és (20) egyenletek egyenlővé tehetők, amely megoldásával a reakció sebességi egyenlete a következő formában adódik (21):
(21)
Az általunk javasolt mechanizmus alapján a k2/k-1 és a K1[TEMPO] << 1, így elhanyagolhatóak. Ennek eredményeként egy bimolekulás sebességi egyenlethez jutunk, amelyet a reakciókinetikai mérések eredményei is alátámasztanak.