A pirokatechin dioxigenázok és modelljeik

Az előző fejezetben tárgyalt enzim szerepe a pirokatechin származékok oxidációján alapul. Oxigénezésük azonban bonyolultabb folyamat, és az erre „szakosodott” enzimek is több módon láthatják el ezt a feladatot. Attól függően, hogy a két hidroxilcsoport között, vagy a gyűrű egy másik pontján katalizálják a C–C kötés felszakítását, megkülönböztetünk intradiol-, vagy extradiol-típusú hasítást (8. ábra).

8. ábra

A pirokatechin dioxigenázok által katalizált reakciók

16

Intradiol hasítást végző enzimek

A 8. ábra felső része a pirokatechin intradiol hasításának reakcióját mutatja.

Termékként cisz,cisz-mukonsavat kapunk, ami adipinsavvá hidrogénezhető. Az adipinsav iparilag fontos nyersanyag műanyagok, vagy természetben lebomló polimerek gyártásához.

Enzimatikus úton történő előállítása tehát divatos téma jelenleg a kémiai és biomérnöki kutatásokban [36]. A szomszédos hidroxilcsoportok közötti gyűrűhasítást több enzim is képes elvégezni különböző szubsztrátum származékokon. Az irodalomban előforduló két fontosabb képviselőjük a talajban található baktériumokból kinyert pirokatechin 1,2-dioxigenáz (1,2-CTD; EC 1.13.11.1) és protocatechuat 1,2-dioxigenáz (PCD; 3,4-dihidroxi-benzoát 3,4-dioxigenáz; EC 1.13.11.3). A korábban bemutatott enzimektől eltérően a katalitikus hatásuk a nagy spinszámú, nem porfirin-vázas vas(III) aktív centrumuknak köszönhető. A 3,4-PCD enzimet már az 1960-as években ki tudták nyerni kristályos formában [37], különböző spektroszkópiai módszerekkel is vizsgálták [38, 39], azonban röntgenszerkezetét csak 1988-ban ismerték meg [40]. A vas(III)ion trigonális bipiramisos környezetben található, két tirozin és két hisztidin, plusz egy víz molekula koordinálódik hozzá alapállapotban. A szubsztrátummal együtt készült röntgenvizsgálat alapján egy fontos szerkezeti változás történik az aktív formájában. A pirokatechinek kétfogú ligandumként kapcsolódnak, és kiszorítanak egy tirozint a koordinációs övezetből, valamint a forma oktaéderesre változik [41].

9. ábra

A pirokatechin 1,2-dioxigenáz javasolt mechanizmusa

Az 1,2-CTD szerkezetének meghatározására jóval később 2000-ben került sor [42].

Az eredmények az mutatták, hogy nincs számottevő eltérés a 3,4-PCD enzimtől. A szerves

17

ligandumok hasonló módon koordinálódnak a központi vashoz, és annak oxidációs állapota nem változik az enzimfolyamat során. Mindemellett ismerve, hogy a triplett állapotú oxigén nagy affinitással rendelkezik gyökös jelleggel rendelkező reakciópartnerekkel szemben, logikus feltételezni egy szemikinonon keresztül induló mechanizmust, ahogy a 9. ábra is mutatja [43].

Extradiol hasítást végző enzimek

A 8. ábra alsó része a pirokatechinek extradiol hasítását vázolja. A katalizált reakcióban való eltérés alapján nem meglepő, hogy szerkezetileg is nagy különbségeket találtak „intradiolos” rokonaikkal szemben. Legszembetűnőbb, hogy a vasion a centrumban ezúttal Fe²⁺ formában található a natív enzimekben. A 2,3-CTD (EC 1.13.11.2) például egy tetramer, ami egységenként egy-egy Fe²⁺-t tartalmaz [44] két hisztidin és egy glutaminsav alkotta környezetben az első elérhető szerkezet alapján.

Érdekesség, hogy 2,3-dioxigenázok más fémeket használó válfajait is azonosították Mn(II) [45, 46] – Arthrobacter globiformis-ból kinyert 3,4-dihidroxi-fenilacetát-2,3-dioxigenáz (EC 1.12.11.15) – és Mg(II) centumokkal [47], – ugyanazon enzim Klebsiella pneumoniae-ból – bár az utóbbi röntgen szerkezete nem ismeretes (10. ábra).

10. ábra

Fe és Mn tartalmú pirokatechin 2,3-dioxigenázok aktív centruma [48, 46]

18

A mechanizmust tekintve alapvető különbség az intradiol és extradiol hasítást végző enzimek között, hogy az előbbieknél molekuláris oxigén jelenléte szükséges az aktív állapot eléréséhez, míg az utóbbiak a szubsztrátum segítségével képesek a dioxigén megkötésére, továbbá az aktiválódásra. A 10. ábra bal oldalán egy nemrég meghatározott [48] vastartalmú 2,3-CTD aktív centruma látható 4-nitro-pirokatechin szubsztrátummal, az enzimreakció különböző fázisaiban. A szerencsés szerkezet-meghatározásra azért kerülhetett sor, mert a tetramer enzim egységei kis részletekben különböznek egymástól, így az egyes egységekben, adott pillanatban, a reakciók nem azonos intermedier szakasznál tartanak.

A hasonló mangántartalmú enzim röntgen adatait is alapul véve, a Lipscomb csoport a 11. ábrán látható extradiol 2,3-dioxigenáz katalitikus ciklust javasolta [49]. Fontos megjegyezni, hogy a feltételezett gyökös mechanizmus miatt, valamint a röntgen, a Mössbauer, ESR és IR mérések alátámasztásával [50] a legújabb kutatások szerint, a fém oxidációs állapota nem változik, és az aktív forma egy Fe(II)-O₂^- (vas-szuperoxo) adduktumban teljesedik ki.

11. ábra (jobbra) Az extradiol hasítást végző 2,3-dioxigenázok javasolt mechanizmusa [49]

19

Az extradiol hasítás lehetősége az 1,2-CTD enzimeknél és modelljeiknél

Kevésbé ismert tény az intradiol hasítást végző enzimeknél, hogy bizonyos szubsztrátumok alkalmazásánál extradiol hasítás során keletkező végtermékeket is lehet azonosítani. 1975-ben Fujiwara fedezte fel, hogy a Pseudomonas fajokból származó 1,2-CTD a 3-metil-pirokatechint – a keletkező termékek alapján – extradiol módon is hasítja.

Később kiderült, hogy akár o-amino-fenollal [51] is hasonló reakciók mehetnek végbe.

Számtalan bioutánzó – főleg vas – komplexet gyártottak a mechanizmus megismerése érdekében [52, 53], de egyelőre még a szelektivitást is nehezen tudják megmagyarázni.

Tény, hogy befolyásoló hatással van a reakció kimenetelét tekintve a fém oxidációs állapota, a szubsztrátum koordinációja és az oldószer is. Ez utóbbira érdemes külön figyelmet fordítani, ugyanis Speier és Tyeklár modellkísérleteikben szubsztituált pirokatechin származékok autooxidációs folyamatait vizsgálva [54] azt találták, hogy az aprotikus, vagy protikus közeg jelenléte már a köztitermékként kialakuló szemikinont is meghatározza. Ez további hatással van a gyűrűnyitási, vagy a benzokinon végtermékek képződésére. A különbségek utalhatnak az enzim aktív centrumában uralkodó hidrofil-hidrofób körülményekre. A fém oxidációs állapotával kapcsolatban ismét csak a modellkísérletekre lehet hivatkozni. Legyen szó Rh^{2+, 3+}, Co³⁺, Ir³⁺ [55], vagy Fe^2+,3+ [53]

komplexekről, többnyire mindenfajta gyűrűhasítási terméket megfigyeltek. A 12. ábrán a leggyakrabban detektált intra-, és extradiol hasítás termékei lettek összegyűjtve a sok esetben alkalmazott 3,5-di(terc-butil)-pirokatechin (dtbcatH₂) példáján keresztül.

12. ábra

Az intradiol és extradiol hasítás termékei dtbcatH₂ szubsztrátum esetén

20