A metán-monooxigenáz enzim (MMO -- EC 1.14.13.25)

A dolgozatban szó volt eddig réz és vas centrummal is rendelkező enzimekről. A metanofil, vagy metanotróf baktériumokban található metán-monooxigenáz (MMO, EC 1.14.13.25.) valahová a kettő közé sorolható. A magyarázat annyi, hogy két jól elkülöníthető formája létezik, a „szemcsés” (particulate – pMMO) és „oldható” (soluble – sMMO). A fémek az enzim szekréció és aktivitás szempontjából is fontos szerepet játszanak. A pMMO-t minden baktérium alfaj (egy kivételével) képes termelni, és rézben gazdag környezet szükséges hozzá, ezen felül réznek köszönhető az aktivitása is. Az sMMO-t már kevesebb példány termeli, főleg rézhiányos környezetben, és valószínűleg ennek köszönhetően az aktív centrumban vas található [56]. Ezek a jellemzők a szubsztrátum specifikusságukat is alapjában meghatározzák. Az első forma a rövidebb egyenes láncú szénhidrogéneket (C1-C5) elsősorban alkoholokká, valamint a megfelelő alkéneket epoxidokká képes oxidálni. A második forma jóval többfajta vegyület átalakítására alkalmas [57, 58]. Ez utóbbiról számtalan publikáció jelent meg és jelenik meg, még a szerkezetének meghatározása után is, ugyanis kutatása minden formában könnyebb az oldhatósága miatt [59]. A 13. ábra részletekben szemlélteti a metán teljes biológiai lebontását jól ábrázolva a MMO szerepét a folyamatban.

13. ábra

A metán teljes biodegradációja a Methylococcus capsulatus (Bath) baktériumban [60]

A továbbiakban a metán-monooxigenáz pMMO formáját mutatnám be részletesebben, ugyanis a 3.3 fejezet címszereplő rendszerének képességei sokkal inkább ehhez hasonlíthatóak.

A sejtmembránhoz kötődő partikuláris metán-monooxigenáz röntgen-szerkezetét 2005-ben Methylococcus capsulatus (Bath) baktériumból Rosenzweig csoportjában

21

határozták meg [61]. A trimer enzim három ~ 100 kDa tömegű egységből áll, ahogy a 14.

ábra mutatja eltérő színekkel. Egységenkénti három aktív centrum jelenlétét feltételezik.

Az egymagvú rézközpont környezetét két hisztidin és egy glutamin alkotja. A közelében a kétmagvú réz körül három hisztidin, valamint az egy másik alegységben levő cink körül két hisztidin, egy glutaminsav és egy aszpartámsav található. A első röntgenszerkezet megmérése után, az elkövetkezendő évek folyamán, különböző kutatóhelyek számos ellentmondó eredményt publikáltak a spektroszkópiai méréseik alapján. Ezek megkérdőjelezni látszanak az előzőleg közölteket. Egy nemrég megjelent összegző cikk [62] alapján a Mössbauer mérések a „cink” központban kétmagvú vasra utalnak, az ESR adatok szerint pedig több különböző rézion is jelen lehet. A tisztítási eljárások következtében kicserélődhetnek egyes fémionok ami a cink jelenlétét kérdésessé teszi. Az EXAFS adatok közeli Cu–Cu kapcsolatra utalnak, így ezek megerősítik az eredeti észlelést [63]. Érdekes, hogy egy másik baktériumból (Methylococcus trichosporium OB3b) kinyert szintén pMMO enzim nemrég bemutatott röntgen szerkezetéből már teljesen hiányzott a cink centrum [64]. Mi lehet akkor a valódi szerkezet? Annak tisztázása csak az alkalmas szubsztrátummal együtt kristályosított röntgendiffrakciós méréstől várható a jövőben.

14. ábra

A pMMO enzim trimer szerkezete normál (a), és sejtmembránra merőleges (b) nézetekből [61]

A szerkezettel kapcsolatos sok bizonytalanság ellenére a kutatók többsége mindenképpen valamilyen rézcentrumot tart valószínűnek a rendelkezésre álló adathalmaz alapján. A számtalan előállított komplex, amelyekkel funkcionálisan próbálják modellezni

22 képes a metánban levő legerősebb alifás C–H kötéseket (kötési energia: 104 kcal / mol) is felszakítani, majd oxidációt véghezvinni.

Komoly figyelmet szerzett például Chan és munkatársainak cikke [66], amely szerint trinukleáris réz-centrumot is tartalmazhat a pMMO. Az állításukat izotróp ESR jelekre, potenciometriás titrálásra és ide kapcsolódó számítógépes DFT (density functional theory – sűrűségfunkcionális elmélet) elméleti számításokra alapozták. Szerintük, a trinukleáris mag tökéletesen beilleszthető az enzim egy hidrofil aminosavakkal teli egységébe, ami ráadásul nem is azoknak az aktív centrumoknak az egyike, amit a röntgenszerkezet alkotói leírtak. Az ide illeszthető hidroxilezési mechanizmus hasonló a 15. ábrán láthatóhoz, annyi különbséggel, hogy az egyik oxigén atom µ3-O-Cu₃ formában alkot hidat három réz között. Néhány korábban előállított, szintén trinukleáris magot tartalmazó Cu²⁺-pirazolát [67] és összetettebb [68] funkcionális modell komplex, és azok pMMO aktivitása jó alátámasztással szolgálnak ehhez a feltevéshez.

Ezektől függetlenül, azonban továbbra is a leginkább elfogadott nézet a kétmagvú centrum jelenlétéhez kötődik. A modellreakciókban a pirokatechin oxidáz enzimmel megegyezően (1.2.2 fejezet), ebben az esetben is a µ-η²:η²-peroxo Cu₂²⁺ és bisz-µ-oxo Cu₂³⁺ formációknak köszönhető az egész enzimutánzó, és ennek alapján feltehetőleg az enzimatikus folyamat is [69, 70]. Az utóbbiról még nem található biológiai hivatkozás, azonban a gyakorlat és az elméleti számítások ebben az esetben mutatják a legerősebb katalitikus képességet. A 15. ábrán látható mechanizmus szerint a „kör” ráadásul még tovább szűkül egy vegyes oxidációs állapotú, kétmagvú rendszerre [71].

15. ábra

A pMMO modellkísérlet mechanizmusa kétmagvú rendszernél [71]

A harmadik lehetséges aktív centrum az enzimben cinket, vagy nagyobb valószínűséggel rezet tartalmazhat. Kicsinek tartják ugyan a valószínűségét, hogy ezen a

23

helyen is katalitikus reakciók játszódjanak le, azonban az egymagvú Cu–O₂ rendszer is képes C–H kötés aktiválásra. A szuperoxo-réz vegyületek side-on és end-on formái – ugyan nem túl nagy hatékonysággal, de – fenolok oxidációjára képesek [69]. A Cu^II–OOH (hidroperoxid) és Cu^II(O₂^•-) (szuperoxid) komplexek – részletes spektroszkópiai mérésekkel igazolva – reaktívak ugyan, de magukban nem képesek C–H kötések bontására, csak valamilyen hidrogén atom donorral (fenol, TEMPOH). Az így keletkező magas vegyértékű réz-oxo (Cu^III=O, Cu^IV=O) formációk az elméleti számolások alapján létrejöhetnek, azonban a gyakorlatban még nem mutatták ki őket. Kialakulásuk heterolitikus Cu^II–OOH, vagy homolitikus O–O kötés-hasadással lehetséges, ami termodinamikailag nem kedvezményezett, mégis racionális magyarázat a mechanizmus szempontjából [65, 72, 73] (16. ábra).

16. ábra

A pMMO egymagvú modell rendszerénél felvázolt lehetséges mechanizmus [65]

A fenti ábrán a réz ebben az esetben egy N–CH₃ rendszert oxidál, amely ráadásul a ligandum egysége. Nehéz olyan egymagvú komplexet találni az irodalomban, ami igazi modellje lehetne az enzimnek. A tesztek szerint a vegyületeknek, amelyek megfelelhetnének ennek a kritériumnak, oxidálni kellene maximum 5 szénatom hosszúságú szénhidrogéneket C2-nél, ráadásul enantioszelektíven [74]. Lucas és Karlin mutattak be egy anizol tartalmú, négyfogú polipiridil ligandumot, ami rézzel toluolt és etil-benzolt volt képes oxidálni, azonban mindehhez a komplex dimerizációja szükséges [70].

24 kumén-hidroperoxid által aktiválva egy akridin származék oxidálását voltak képesek elérni [75].

Ezek a cikkek mind egyedi eseteket mutatnak be C–H kötés aktiválására, így funkcióban közel állnak a pMMO-hoz. Specifikusságukról és több szubsztrátummal szemben mutatott viselkedésükről azonban a rendelkezésünkre álló adatmennyiség rendkívül hiányos.

Amennyiben a fentiekben egymagvú rézrendszerekről volt szó, két további enzimet érdemes még röviden megemlíteni. Ezek a dopamin-β-monooxigenáz (DβM – EC 1.14.17.1) és peptidil-glicin monooxigenáz (PHM, EC 1.14.17.3). Mindkét enzim aszkorbát segítségével (hidrogén absztrakció) képes hidroxilezni C–H kötéseket [76, 77]

(17. ábra).

17. ábra

A DβM és PHM enzimek biológiai funkciója [76]

A 17. ábra a DβM dopamin, és PHM peptidil-glicin oxidációját szemlélteti az erre alkalmas enzimek segítségével. Az esetek többségében, amikor pMMO aktivitásról, CH kötés oxidálásról esik szó a modellkísérletek során, ezek az enzimek is szóba kerülnek. A 16. ábrán bemutatottakhoz hasonlóan feltételezik működésüket, ami egyben a PHM tökéletes funkcionális modellezését is mutatja. Ha a jövőben bizonyossá válik, hogy a pMMO egymagvú aktív centrumot is tartalmaz, akkor talán majd az ezekkel az enzimekkel végzett kísérletek is hozzájárulnak a mechanizmus megfejtéséhez.

25

2 H₂O₂ 2 H₂O + O₂