3. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK
3.3. A Cu(I)-(bpy)-(DBCat) rendszer. Pirokatechin dioxigenáz, vagy pMMO modell?
[141]
A pirokatechinek aminálása az irodalmi hivatkozások szerint bázisos közegben, gyökanionon keresztül lejátszódó folyamat [142]. A reakció felgyorsítása érdekében réz(II)sókkal próbáltuk katalizálni a folyamatot sikertelenül. 2,2’-bipiridilt (bpy) ligandumként használva, és réz(I)-kloridra váltva sem kaptuk meg a kívánt amino-fenolt, azonban sikerült a reakció végén egy olyan komplexet kikristályosítani, amely – meglepő módon – oxálsavat (oxH2) tartalmazott hídligandumként a két réz(II)ion között. A reakció során CuCl-t, bpy-t. DBCatH2-t és difenil-amint kevertünk össze ekvimoláris mennyiségben acetonitrilben (40). Az elegy oxigénfelvételét gázbürettás módszerrel
66
követtük nyomon. A termékeket röntgendiffrakciós méréssel, spektroszkópiai módszerekkel és a komplexek elbontása és diazo-metános észterezése után gázkromatográfiával azonosítottuk. Ezek alapján [Cu(bpy)(ox)]n és Cu(bpy)Cl2 komplexeket nagyjából azonos mennyiségben, valamint DBCatH2-t kaptunk, és a reakció szempontjából indifferens difenil-amint.
(40)
A 36 komplex már régebb óta ismert [143], azonban a 35 szerkezete kissé eltér a korábban bemutatottakétól [144]. Az utóbbi röntgenszerkezetét az 50. ábra, spektroszkópiai adatait a 14. táblázat, fontosabb kötésszögeit és kötéstávolságokat pedig a 15. táblázat tartalmazza. A krisztallográfiai adatok a 16. táblázatban találhatóak.
50. ábra
A [Cu(bpy)(ox)]n 35 komplex röntgendiffrakciós képe
67
14. táblázat. A 35 komplex fizikai tulajdonságai és spektroszkópiai adatai
Komplex [Cu(bpy)(ox)]n
Szín halványzöld
IR (KBr; cm-1) 1650, 1621, 1405, 1343
UV-Vis (DMF) log ε267 = 3,77; log ε298 = 3,92; log ε417 = 1,42 Elemanalízis (számított) C: 46,80; H: 2,60; N: 9,10
Elemanalízis (mért) C: 46,60; H: 2,50; N: 8,90 ESR (77 K) gII = 2,173; g┴ = 2,070
15. táblázat. Fontosabb kötésszögek és kötéstávolságok a 35 komplexben
Atompár Kötéshossz (Å) Atompár Kötéshossz (Å)
O6–Cu1–O53 91,10 N35–Cu2–N11 81,30
O6–Cu1–O30 76,80 O28–Cu2–O43 77,80
N13–Cu1–N20 80,50 O3–Cu2–O4 79,10
16. táblázat. A 35 komplex krisztallográfiai adatai
Komplex [Cu(bpy)(ox)]n
Összegképlet C12H8N2Cu1O4
Molekulatömeg 627,68 g/mól
Hőmérséklet 293 K
Besugárzási hullámhossz Mo-Kα (λ = 0,71073 Å) Kristályrendszer triklin
Elemi cella térfogata 684,73 Å
Z 1
Sűrűség (számított) 1,522 g/cm3 Abszorpciós koefficiens 0,933 mm-1
F(000) 329 Megfigyelt reflexiók száma 2333
Végső R [I>2σ(I)] R1 = 0,0303 , wR2 = 0,0952
68
A [Cu(bpy)(ox)]n komplex azonosítására az IR spektrumában leginkább az aszimmetrikus karboxilátcsoport νas(CO2) = 1650 cm-1 rezgés a legalkalmasabb.
Szimmetrikus párja νsym(CO2) = 1343 cm-1-nél található.
A fontosabb elnyelési sávok az UV-Vis spektrumban 267 és 298 nm-nél vannak.
Ezek a két ligandum és fém közötti töltésátvitelhez rendelhetőek.
A röntgenszerkezet alapján minden rézion körül két-két oxalát és egy bpy található polimerláncot alkotva. Cu1 és Cu2 azonban nem teljesen egyformák: a kötésszögekben és kötéstávolságokban apró eltérések fedezhetőek fel.
Nyilvánvalóan, eredeti tervünk a pirokatechinek aminálásával kudarcot vallott, azonban helyette egy nem kevésbé érdekes terméket kaptunk. A 35 komplexben a rézionok közötti hidat alkotó oxalát legnagyobb valószínűséggel ugyanis, az oldószerként alkalmazott acetonitrilből származik. A reakció teljes feltérképezése érdekében először a sztöchiometriát igyekeztünk tisztázni. Az említett reaktánsokon kívül a dioxigén is fontos szerepet játszik, így annak felvételét vizsgáltuk először (51. ábra). A nyomjelzett kísérletek esetünkben megfelelő módszernek bizonyultak (52. ábra) az oxalát eredetének bizonyítása végett. Az utóbbi méréseket 13CH3CN-ben és 18O2-ben viteleztük ki.
51. ábra
A [Cu(bpy)(ox)]n komplex dioxigén felvétele. Oldószer: 5 ml, [CuCl] = [bpy] = [DBCatH2] = 5 mmól, 25°C, 1 bar O2
69
Hullámszám (cm-1) 52. ábra
Izotóppal jelzett termékek IR spektrumai a 35 komplexszel
Az izotóppal jelzett acetonitrilben is és 18O2 atmoszférában is, a reakcióból származó IR spektrumokban láthatóan mind az aszimmetrikus, mind a szimmetrikus νCO
jelek jelentősen eltolódtak. Mindezeken felül lehetőségeink szerint a legtisztább oldószereket és reagenseket használtuk, így nem sok kétség maradt, hogy az oxalát-híd valóban az oldószerből származik. További bizonyítékként DFT kvantum kémiai számításokkal is alátámasztottuk feltevéseinket. Az eredmények együtt láthatóak a 17.
táblázatban, zárójelben mutatva a számított izotóp eltolódásokat cm-1-ben az eredeti kísérlethez képest.
17. táblázat. A 35 komplexszel végzett izotópos kísérletek IR jelei (cm-1)
Rezgés
[Cu(bpy)(ox)]n 35 35 12CH3CN + 18O2 35 13CH3CN + 16O2 kísérleti számolt kísérleti számolt kísérleti számolt νννν7 1650 1659 1643(7) 1650(9) 1644(6) 1648(11) νννν1 1621 1625 1606(15) 1611(11) 1591(30) 1588(37) νννν2 1405 1427 1397(8) 1414(13) 1373(30) 1413(14) νννν8 1343 1326 1333(10) 1302(24) 1329(14) 1313(13) A legnagyobb frekvenciájú ν7 IR sávok 6-11 cm-1 közötti eltolódásokat mutattak a referenciaként használt normál dioxigénben és acetonitrilben végzett kísérletekhez képest.
16O2, 12CH3CN
18O2, 12CH3CN
16O2, 13CH3CN
70
Az eltérés a mért és számított értékek között minimális. A ν1 és ν2 közepes intenzitású IR-sávok mutatták a legnagyobb mértékű izotóp eltolódásokat (akár 30-37 cm-1 is).
Mindazonáltal, ezek sajnos nem rendelhetők pontosan hozzá egy bizonyos kötés rezgéséhez elsősorban a bpy-ligandum jeleivel történő átfedések miatt. Csupán egy kérdéses sáv maradt, ez pedig a 13CH3CN-ben mutatkozó 1373 cm-1-es. Ez lehet az eredeti 1405 cm-1 erősen negatív eltolódású párja, azonban ez ellen szól, hogy a számított 1413 cm-1-nél is található egy rezgés. A spektrum összetettsége ebben az esetben sem teszi lehetővé a pontos meghatározást.
Kísérletsorozataink alapján eddig a pontig ki tudtuk zárni az amin szerepét, ugyanis hiányában a dioxigénfelvétel és a termék is változatlan. Cu2+-sókat használva nem találtuk az oxalát híd jelenlétét, valamint nem vonható kétségbe a bpy koordinációja a rézhez.
További tapasztalataink, hogy DBCatH2 alkalmazása nélkül nem a kívánt komplex keletkezése észlelhető, mégis a gázkromatográfiás elemzés az „érintetlen” pirokatechint mutatta a reakció végén. Az irodalmi ismeretekink szerint a pirokatechin oxidáz enzimeknél a szubsztrátum a réz(II)központokat képes redukálni, de ott benzokinon állapot a végleges. UV-Vis spektroszkópiával ezúttal is sikerült DBQ-t kimutatni, ami azonban a ciklus végével visszaalakult DBCatH2-vá (53. ábra).
λλλ λ (nm) 53. ábra
DBQ képződés és visszaalakulás a [Cu(bpy)(ox)]n komplex képződése során Oldószer: 5 ml MeCN, [CuCl] = [bpy] = [DBCatH2] = 5 mmól, 25°C, 1 bar O2
71
Mindezekután elégséges információ állt birtokunkban, hogy a reakció pontos sztöchiometriáját leírjuk. Ez a következőképpen alakul:
(41)
Az oldószerként alkalmazott vegyületek hatásának vizsgálata a reakció kimenetelére nem maradt ki a méréssorozatinkból. A szénlánc méretét csupán eggyel növelve, azonban újabb váratlan eredményeket kaptunk. Propionitrilben elvégezve az oxidációt a korábbiaktól eltérő új [Cu(bpy)(bma)H2O]n összetételű komplexet sikerült előállítanunk, ahol bmaH2 = 2-terc-butil-maleinsav.
(42)
Ebből az anyagból is sikerült röntgendiffrackiós mérésre alkalmas kristályokat növesztenünk. A réz(II)ionok geometriája torzult síknégyzetes piramisos szerkezettel jellemezhető (τ = 0,12). Az alapsíkban a bpy ligandum két nitrogénje és két maleát egység egy-egy oxigénje helyezkedik el. Axiális helyzetben egy vízmolekula koordinációja figyelhető meg. A szerkezet az 54. ábrán látható, a fizikai és spektroszkópiai tulajdonságai pedig a 17-19 táblázatokban.
54. ábra
A [Cu(bma)(bpy)(H2O)]n (37) komplex röntgendiffrakciós képe
72
17. táblázat. A 37 komplex fizikai tulajdonságai és spektroszkópiai adatai
Komplex [Cu(bma)(bpy)(H2O)]n
Szín kék
Olvadáspont (°C) 266
IR (KBr; cm-1) 1645, 1601, 1446, 1374, 776
UV-Vis (DMSO) log ε260 = 3,78; log ε302 = 4,03; log ε423 = 1,61 Elemanalízis (számított) C: 53,00; H: 4,90; N: 6,90
Elemanalízis (mért) C: 52,80; H: 4,70; N: 6,70 ESR (77 K) gII = 2,270; g┴ = 2,050; CuAII = 177 G
18. táblázat. Fontosabb kötésszögek és kötéstávolságok a 37 komplexben
Atompár Kötéshossz (Å) Atompár Kötéshossz (Å)
Cu1–O19 1,969 Cu1–N1 2,003
Cu1–O22 1,952 Cu2–N2 1,992
Cu1–O23 2,371
Kötés Kötésszög (°) Kötés Kötésszög (°)
N1–Cu1–O19 165,74 O19–Cu1–O23 99,17
N2–Cu1–O22 172,87 N1–Cu1–N2 81,10
N1–Cu1–O23 94,90 O19–Cu1–O22 88,91
19. táblázat. A 37 komplex krisztallográfiai adatai Komplex [Cu(bma)(bpy)(H2O)]n
Összegképlet C18H37N2Cu1O12
Molekulatömeg 537,04 g/mól
Hőmérséklet 293 K
Besugárzási hullámhossz Mo-Kα (λ = 0,71073 Å) Kristályrendszer monoklin
Elemi cella térfogata 2484,33 Å
Kristály méretei 0,4 mm × 0,4 mm × 0,2 mm
Z 4
Sűrűség (számított) 1,436 g/cm3 Abszorpciós koefficiens 0,940 mm-1
F(000) 1136 Megfigyelt reflexiók száma 4133
Végső R [I>2σ(I)] R1 = 0,0566 , wR2 = 0,1250
73
2 CuCl + DBCatH2+ 2 bpy + 3 O2 CH3CH2CN 36+37+ H2O + mellékermékek A 37 komplex UV-Vis spektruma kis mértékben különbözik a 35-től. Az IR spektrumban a meghatározó különbség a két komplex között a szimmetrikus és aszimmetrikus ν(CO) rezgéseik közötti távolság (1645, 1374 cm-1), ami a 37 esetében valamivel nagyobb ∆ν = 271 cm-1. Ugyanez a távolság 35 esetén ∆ν = 245 cm-1.
A paramágneses komplex ESR spektruma axiális szimmetriát mutat (gII > g┴), valamint a g tenzorok értékei alátámasztják a négyzet alapú piramis geometriát [145].
55. ábra
A [Cu(bpy)(bma)H2O]n komplex dioxigén felvétele. Oldószer: 5 ml, [CuCl] = [bpy] = [DBCatH2] = 5 mmól, 25°C, 1 bar O2
Az acetonitrilben végzett kísérletekhez hasonlóan ebben az esetben is megmértük a dioxigén felvételt (55. ábra), és a korábbi ismereteinket alapul véve a reakció pontos sztöchiometriáját is meghatároztuk (43).
(43)
Ahogy a (43) egyenlet is mutatja, az oldószer ezúttal nem reagensként szerepel. Az acetonitriles kísérletektől eltérően itt a pirokatechin gyűrű teljes kémiai hasítását tapasztaltuk. Mindezek a megfigyelések természetesen felvetették a kérdéseket, hogy más oldószerek milyen hatással vannak a folyamatra, valamint különböző nitrogén-donor ligandumok, rézsók és pirokatechinek is megváltoztathatják-e a reakciók kimenetelét? A kérdéseket megválaszoló kísérletek eredményei a 20. táblázatban találhatóak.
Alapkísérletnek a (41) és (43) egyenleteket vettük, a táblázatban pedig csak a megváltoztatott paraméter lett feltüntetve.
74
20. táblázat. A Cu-bpy-DBCatH2 rendszer részletes vizsgálata Megváltoztatott
75
Az eredmények alapján látható, hogy az elektronszívó csoportokat tartalmazó pirokatechin-származékok nem képesek a leírt reakciók véghezvitelére. Az elektronküldő csoportokat tartalmazók közül is csak azok hatékonyak, amelyeken az alifás oldalláncok hosszabbak, magasabb rendű szénatomokat tartalmaznak.
A választott nitrogéndonor ligandumok mind jól koordinálódnak a rézionhoz, azonban a hatásukra kialakuló redoxpotenciál értéke eltérő. Az elvárt oxalát- és maleáttartalmú termékeket csak az 1,10-fenantrolin és terpiridin esetén azonosítottuk. A neocuproin a Cu(I)-t nagyobb mértékben stabilizálja, így termékképződés annál nem volt tapasztalható. A nitrogéntartalmú kétfogú ligandumok nélkül a kívánt reakciók nem vitelezhetőek ki.
A fém sói közül egyértelműen a réz(I)ionokat tartalmazók az aktívak. Ennek a faktornak a változtatása a legkisebb százalékkal volt hatással a reakció lefolyására.
Mindazok ellenére, hogy a termékek keletkezése IR spektroszkópiával jól nyomon követhető, a különböző oldószerek használatával mégsem lehetünk teljesen biztosak az oxalát képződésben. Nagy valószínűséggel megállapítható azonban, hogy a rövidebb szénlánccal rendelkező oldószereket a rendszerünk savakká képes oxidálni, amelyek azután a rézionhoz koordinálódnak.
76
Az acetonitrilben és propionitrilben végzett kísérletek eredményeit összegezve a Cu(I)-(bpy)-(DBCat) komplex-rendszer enzimutánzó tulajdonságai tükröződnek az eredményeken.
Rövidebb szénláncú oldószer jelenléte esetén annak oxidálódása tapasztalható. Ez a kritérium a pMMO enzim egyik legszembetűnőbb tulajdonsága. További párhuzam, hogy ez éppen egy rézmaggal rendelkező biokatalizátor. Lehetséges magyarázatot keresve a jelenségre a 11. és 16. ábra dioxigén-aktiválási mechanizmusát lehet alapul venni. A kisméretű acetonitril molekulák a rézionok környezetében nagyobb valószínűséggel kerülhetnek olyan pozícióba, hogy a 11. ábra d) lépése helyett a pirokatechint egyszerűen kiszorítják a reaktív oxigén gyökök, gyökanionok szférájából. A kísérleteinket minden esetben dioxigénben, levegő kizárásával végeztük, vagyis annak folyamatos utánpótlása biztosított volt, így az oxidáció kétértékű sav keletkezéséig játszódhatott le. A ciklus végén a formálódó oxalát koordinációja a pirokatechin rekombinációját eredményezte.
Az oldószer szénatomjainak a számát növelve annak szerepe a hátérbe kerül. A DBCatH2 által redukált rézionok egyéb alkalmas reakciópartner híján a molekuláris dioxigén közreműködésével a pirokatechint magát kezdik a dioxigenázokhoz hasonlóan hasítani és oxidálni. A pirokatechinek extradiol hasítását végző enzimekkel kapcsolatos irodalmi hivatkozások között nagyon nehéz olyat találni, amelyik a 3,4-dioxigenázoktól eltérőt említene. Vassal és más fémekkel végzet modellkísérletek során azonban számtalan melléktermék keletkezik, többek között maleinsavanhidrid (12) is (12. ábra). A Funabiki által javasolt mechanizmust [146] kombinálva a manapság elérhető legfrissebb eredményekkel [49, 50], a lehetséges oxigénezés a (44) reakciósorozat szerint alakul.
(44)
77
A pirokatechin oxidáz enzimet utánzó reakcióknál néhány esetben hidrogén-peroxid képződését is tapasztaltuk. Ezzel együtt más biológiai folyamatok eredményeként is keletkezhet ez a belső szervekre, szövetekre meglehetősen ártalmas vegyület. Ahogy az irodalmi áttekintésben is említésre került, a szervezetek természetes védekezése ez ellen az anyag ellen elsősorban a kataláz enzimmel valósul meg.
Ebben a fejezetben a rendkívül egyszerű (6) reakciót alapul véve a már ismertetett gázvolumetriás módszer alkalmazásával (a hidrogén-peroxidból képződő dioxigén méréséhez) kataláz funkcionális modelleket szándékozunk bemutatni. Egyrészt egy az enzim fémtartalmától eltérő Cu2(bpy)2(phga)4 (phgaH = fenil-glioxilsav) réz komplexen keresztül, másrészt a mangán katalázokhoz jobban hasonlító, prolin alapú ligandumot tartalmazó, kétmagvú mangán komplexszel.
3.4.1. A Cu2(bpy)2(phga)4 előállítása, szerkezete, katalitikus hatása a H2O2 dizmutációjára [147]
A 3.3 fejezet kísérletsorozatai során a termékek azonosítása érdekében a bpy mellett a legkülönfélébb egyszerű savakat próbáltuk alkalmazni másodlagos ligandumként komplexképzéshez. Így jutottunk el a fenil-glioxilsavhoz, amelynek felhasználásával olyan vegyületet sikerült előállítanunk, ahol a phga terminális és hídligandumként is funkcionál (45). (Az előállítás részletesen a kísérleti fejezetben megtalálható.) A terméket az anyalúgból sikerült kikristályosítani, melynek során röntgendiffrakciós mérésre alkalmas egykristályok keletkeztek (56. ábra).
(45)