1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
1.2. Metalloenzimek és modelljeik
1.2.5. A kataláz enzim (EC 1.11.1.6)
A 240 kDa tömegű kataláz (EC 1.11.1.6) az egyik legfontosabb védelmi funkciót ellátó enzim. A különböző biológiai folyamatok melléktermékeként keletkező hidrogén-peroxid oxigénné és vízzé alakítását katalizálja az enzimek közül a legnagyobb hatásfokkal (kcat/KM = 4,00 × 108 M-1 s-1). Az emberi szervezetben például az összes termelődő H2O2 felét alakítja át, nem csekély védelmet nyújtva ezzel a hemoglobinnak [78].
(6)
Minden állat minden szervében „használ” katalázt, de különösen a májban.
Ismerve, hogy ez az elsődleges méregtelenítő szerv, ez nem meglepő. Fő feladatán kívül szerepet játszik még sejt apoptózis megelőzésében [79], mutagenézisnél [80], számos tumor stimulálásánál [81], valamint gyulladásos betegségeknél [82]. Hiánya az úgynevezett acatalasemia, vagy Takahara genetikai betegségben mutatkozik [83]. Az agyban olyan funkciója is ismeretes, hogy képes az etanolt acetaldehiddé alakítani, amely vegyület az ittasság és a vele járó egyéb neurológiai hatások kiváltója [84].
Oscar Loew német kémikus számos növényből és állatból készített enzim kivonatot, és ő használta először a kataláz nevet több mint egy évszázada [85]. Aminosav szekvenciáját már 1969 óta ismerik [86], három dimenziós röntgen szerkezetét pedig 1981-ben határozták meg [87]. A tetramer formát négy több mint 500 aminosavat tartalmazó polipeptid lánc alkotja. Az egységenkénti aktív centrumok egy-egy porfirin gyűrűbe zárt vasból állnak, ami kb. 25 Å távolságra van az enzim felszíntől. (18. ábra).
18. ábra
Emberi eritrocitából (vörösvérsejt) származó kataláz és aktív centruma [88]
26
+ OH
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH
A protein gombolyagban mélyebben ülő hem központ egy 25 Å hosszú, folyamatosan szűkülő csatornán keresztül kapcsolódik a felszínhez. Ez egy felettébb különös képződmény, ugyanis nem csak kis molekulák keresztülhaladását teszi lehetővé, hanem egyedi felépítése révén szelektivitást is biztosít. A falát aminosavak (tirozin, fenil-alanin, valin, triptofán) hidrofób oldalláncai alkotják. A belső részt vízmolekulák tömege veszi körül a csatorna egész hosszán keresztül. A keresztmetszet annyira lecsökken a maghoz közeli utolsó szakaszon, hogy már csak olyan kis molekuláknak marad hely az átjutáshoz, mint a hidrogén-peroxid [88].
A 19. ábrán a hem központhoz vezető csatorna látható a zöld színű aminosav építőelemekkel, és a belső fal mellett felhalmozódott, pirosra festett vízmolekulákkal.
19. ábra
Emberi eritrocitából (vörösvérsejt) származó kataláz aktív centrumához vezető csatorna [88]
Az élőlényekben található szabad vasionoknak sokfajta káros hatása ismert.
Különösen nagy figyelmet érdemes fordítani a FeII ionok Fenton, vagy Haber-Weiss folyamatokban [89] történő hidroxil-gyök (•OH) képzésére (7).
(7)
A reakció ugyan már nem új felfedezés, de jelentősége mindmáig nagy, ugyanis számos súlyos betegség közvetett kiváltó okának tartják. Köze van szívrohamhoz, szélütéshez, szervi rendellenességekhez ugyanúgy, mint a legismertebb neurodegeneratív betegségekhez, mint például Alzheimer-kór, Parkinson-kór, Huntington-kór [90]. A megfelelően kötött vas (többnyire Fe3+) azonban, éppen az ellenkező reakciót képes katalizálni, vagyis a káros gyökök, peroxidok, hidroxidok lebontását (szuperoxid-dizmutáz, kataláz). A emberi kataláz enzimben a Fe3+-ion egy hem szerkezetben (négy N atom által) van rögzítve, plusz még egy tirozin (Tyr358) koordinálódik hozzá. Ez utóbbinak és a hem
27 hidrogén-peroxid molekulák, az utóbbi kettő aminosav elektronszívó tulajdonsága segítségével, és az aktív centrum elektronokban gazdag magja közreműködésével megindul a peroxid kötés heterolitikus hasítása (20/a ábra). A következő lépésében kialakul egy olyan formáció, amit egyszerűen „vegyület I”-nek kereszteltek el (20/b ábra).
(a.)
(b.)
20/a,b ábra
A hidrogén-peroxid lebontásának mechanizmusa a kataláz enzimben [88]
28
A hidrogén-peroxid lebontásának mechanizmusa a kataláz enzimben [88]
Miközben „vegyület I” kialakul, a hemhez közeli arginin (Arg354) a hisztidin (His218) és aszparagin (Asp348) irányában olyan semlegesítésbe kezd, ami végül enyhíti a töltés-taszítást a porfirin π-gyök-kationnal, valamint csökkenti a polarizációt az amúgy is már elektron hiányos Tyr358-Fe4+=O rendszeren. A redoxpotenciál további változtatásában a 18. ábrán látható fenil-alaninek (Phe153, Phe161), és argininek (Arg72, Arg112, Arg365) is részt vesznek [88]. A folyamat következő részében a „vegyület I”
„vegyület II”-vé redukálódik (8) [91].
(8)
Ebben az állapotban az enzim inaktív. A ciklus utolsó szakaszba lépéséhez NADPH-ra (nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát) van szükség, ami egy elektronos reakcióban reaktiválja, azaz más megfigyelések szerint megakadályozza a „vegyület II”
kialakulását. A második H2O2 oxidálódásával az enzim visszatér nyugalmi állapotába.
Számos kísérletet elvégeztek ugyan a NADPH szerepének tisztázására, azonban a kép a mechanizmusról továbbra sem teljes. Kérdéses például, hogy a NADPH hogyan képes egy elektronos reakciót véghezvinni, amikor kételektronos folyamatairól ismert. A „vegyület II”-t sikerült ugyan kimutatni, de feltételezik, hogy csak alacsony H2O2 koncentráció
29
esetén van ideje kialakulni. Magas hidrogén-peroxid koncentrációnál elvégzett kísérletekről egyelőre nincsenek az irodalomban elérhető adatok [92].
Úgy tűnik, hogy a vas tökéletesen alkalmas a feladat elvégzésére, azonban a természet mégis produkált egy enzim-változatot. Ahogy az előző fejezetben bemutatott MMO-nak is, úgy a kataláznak is van egy másik fémet tartalmazó formája, ez esetben mangántartalmú. Felfedezésük úgy kezdődött, hogy a Pediococcus Cerevisiae és számos más laktonsav baktériumból kinyert kataláznál nem működött a cianid-inhibíció [93, 94].
A korábban pszeudokatalázként emlegetett enzimekről 1982-ben derült ki, hogy mangánt tartalmaznak, és homohexamer formában léteznek [95]. Az első röntgenszerkezetet már 1986-ban sikerült meghatározni [96], azonban 2000-ben és utána a felbontás javításával, egyre több információ került napvilágra [97, 98]. A megismert szerkezet és funkció összehasonlításával, a kétmagvú mangántartalmú enzimek mangán kataláz és mangán peroxidáz alcsoportokra választhatók szét. A Lactobacillus plantarum mangán kataláza homohexamer formában létezik (21/a. ábra).
Minden egyes mangániontól 15 Å távolságra 1-1 Ca2+ található. Ezek nyolcas koordinációjúak, valamint a monomerek szélein helyezkednek el. Ligandumjaik a szomszédos protein egységekből származnak, vagyis szerepük a szerkezet alakításában és összetartásában van.
21/a ábra (balra)
A mangántartalmú kataláz enzim szerkezete [98]
21/b ábra
A mangán kataláz enzim aktív centruma [98]
30 formáló glutaminsavból (Glu66) származó karboxilát (21/b ábra). Erre a felállásra jellemző tipikus ESR érték a J = -20 cm-1 gyenge csatolási állandó a két nagy spinszámú, egymástól 3,03 Å távolságra lévő, azonos vegyértékű Mn2+-ion között [99]. A mechanizmus meghatározásánál is főleg az ESR és az EXAFS adatok játszottak szerepet. Ezek segítségével bizonyították ugyanis, hogy az egész körfolyamat a MnIIMnII és MnIIIMnIII állapotok közötti átmenetnek köszönhető (22. ábra) [98, 100, 101].
22. ábra
A mangántartalmú kataláz enzim feltételezett mechanizmusa [98]
A fenti mechanizmus egy oxidációs és egy redukciós félfolyamatból áll. Mindkét forma reagál a H2O2 szubsztrátummal. Részben ennek köszönhetően, és részben az enzimatikus reakció gyorsasága (kcat ≈ 105 s-1) [97] miatt precíz megállapítások még nem születtek. Sokkal nagyobb hangsúlyt fektetnek a kutatók azonban a modellvegyületekkel végzett kísérletekre. Ezeknek természetesen megvan az előnyük és hátrányuk is. A legjobbak közel állnak az enzim valódi mechanizmusához, de sajnos nem túl effektívek, a funkcionalitásban közel állók pedig hatékonyak, de nem a valós enzimreakciót tükrözik. A 23. ábra néhány véletlenül kiválasztott mangán- és réztartalmú modell és a különböző baktérium fajokból származó enzim kinetikai adatait mutatja.
31
2. táblázat. Egy-, és kétmagvú kataláz modellek szerkezeti és kinetikai adatai
Komplex, baktérium M–M 1,3-bisz(szalicilidén-imináto-propán) komplex [102, 103] mindmáig a legjobb funkcionális modellje a mangán kataláznak. A katalitikus ciklus alatt azonban a központi ionok a MnIV és MnIII oxidációs állapotok között mozognak. A további két mangántartalmú példa szintén a jobb modellek közé tartozik, de főleg a MnII/MnII - MnIII/MnIII átmenet szempontjából.
Komplexek tucatjait lehetne még bemutatni, azonban azok messze alulmúlják az enzim teljesítményét [108, 109]. A területen dolgozó tudósok szerint a [MnIII2(µ -O)(OH2)(OAc)benzimpn]+ (benzimpn = N,N,N’,N’-tetrakisz-(2-metilén-benzimidazoil)-1,3-diamino-2-propanol) irányába érdemes további kutatásokat folytatni.
Mn
32
A modellreakciók egyszerűségének és a téma divatosságának köszönhetően eltérő fémet tartalmazó vegyületekkel is szép számban találhatók kataláz utánzó reakciók. Az enzimatikus hatékonyság összehasonlítását a kobs pszeudo elsőrendű reakciósebességi állandó segítségével teszik. Különlegesebbnek mondhatóak a réztartalmú komplexek [106, 110], mivel erre a fémre H2O2 dizmutációval kapcsolatos biológiai vonatkozást ugyan még nem találtak, de láthatóan számos mesterséges vegyület képes ilyen reakciót katalizálni. A vastartalmú modellek száma már nagyságrendekkel nagyobb. Fellelhetőek hem típusúak és egyszerűbb felépítésű egy-, vagy kétmagvú komplexek is. A referenciák, és a 2.
táblázatban látható adatok alapján elmondható, hogy kinetikai értékeik az enzimétől távol, szűkebb határokon belül mozognak, ami ideálissá teheti őket a lehetséges mechanizmus meghatározásra.
33