Az MDR1 és MRP1 párhuzamos detektálása

Az a megfigyelés, hogy a calcein AM-et mind az MDR1, mind az MRP1 hatékonyan képes kipumpálni a sejtekből, azt a lehetőséget kínálta, hogy a calcein assay diagnosztikai célú alkalmazásánál képesek lehetünk mindkét multidrog transzporter funkcionális jelenlétét meghatározni. A módszer kidolgozásánál az alapvető elképzelés az volt, hogy szelektív gátlószer alkalmazásával először az egyik transzporter festékeltávolító aktivitását függesztjük fel, majd a másikét, így szétválasztva a két transzportaktivitást.

Mivel az MRP1 még az MDR1-nél is szélesebb szubsztrát-felismerő képességgel rendelkezik, elsősorban olyan inhibitort kerestünk, amely szelektíven az MRP1-et gátolja.

Többféle vegyület is alkalmasnak bizonyult a két transzpert megkülönböztetésére, azonban kritikus volt a megfelelő inhibitor koncentráció meghatározása. Hármas kritérium rendszert állítottunk fel: egyrészt hogy az inhibitor teljes mértékben gátolja az MRP1-et, másrészt hogy legkevésbé se gátolja az MDR1-et, harmadrészt hogy ne befolyásolja a sejtek állapotát, illetve az észteráz aktivitást. Ezek a tulajdonságok és ennek következtében az ideális küszöb-koncentráció azonban némiképpen függött a mintáktól és az alkalmazott technikától (kevert küvettás fluoriméter vagy áramlási citométer, stb.)

A módszer beállításához és finomhangolásához MRP1-et és MDR1-et expresszáló sejteket (HL60 MRP, 3T3 MDR) használtunk. Mivel a verapamil 50-100 μM tartományban - az észteráz aktivitás befolyása nélkül - teljes mértékben gátolja mindkét transzporter festékeltávolító aktivitását, pozitív kontrollként ezt a vegyületet használtuk. A 8. ábrán bemutatott áramlási citométerrel végzett kísérletben az MRP1 gátlására 10 μM MK571-et alkalmaztunk, amit eredetileg leukotrién D4 receptor antagonistaként hoztak forgalomba, de az MRP1-nek is hatékony és szelektív gátlószerének bizonyult. A HL60 MRP sejtekben ez a gátlószer koncentráció teljes mértékben gátolta az MRP1 festékeltávolító aktivitását (8a ábra), az MDR1 aktivitására azonban csak csekély mértékben hatott (8b ábra). Érdemes felhívni a figyelmet arra, hogy az ábrán logaritmikus skála szerepel, ezért az MDR1 gátlása mindössze kb. 5 %-ra tehető.

Ezt követően különböző arányokban (50-50 %, illetve 5-95 %) összekevertük az MRP1-et és MDR1-MRP1-et expresszáló két sejttípust, és megmutattuk, hogy az MK571 és a verapamil alkalmazásával a calcein assay segítségével a két multidrog transzporter aktivitása egymástól függetlenül is detektálható - még akár olyan kevert sejtkultúrákban is, ahol az egyik transzportert expresszáló sejtek aránya mindössze 5 %-ot tesz ki (8c-d ábra).

8. ábra: Az MDR1 és MRP1 funkcionális elkülönítése áramlási citométer használatával. a-d) HL60 MRP és 3T3 MDR sejteket különböző arányban kevertük és 0,25 µM calcein AM-mel inkubáltuk DMSO (oldószer-kontroll, zöld), 10 µM MK571 (MRP1 gátlószer, kék) vagy 60 µM verapamil (MDR1-MRP1 inhibitor, piros) jelenlétében, majd a mintákat áramlási citométerben vizsgáltuk. a) 100% HL60 MRP b) 100 % 3T3 MDR c) 50-50 % HL60 MRP és 3T3 MDR d) 5% HL60 MRP and 95 % 3T3 MDR sejt. e) MRP1 aktivitás detektálása akut mieloid leukémiában szenvedő beteg perifériális véréből izolált mononukleáris sejtekben. A kísérletet az előzőekhez hasonlóan végeztük annyival kiegészítve, hogy a betegmintát propidium-jodiddal (PI) is inkubáltuk, és az elpusztult sejteket a PI-festődés alapján kizártuk.

A calcein assay diagnosztikai célra történő alkalmazását a 4.1.3. fejezetben mutatom be részletesen leukémiás betegekből nyert mintákon. Azokat a vizsgálatokat még úgy indítottuk, hogy nem volt a kezünkben az MDR1 és az MRP1 aktivitását egymástól függetlenül meghatározó módszer, ezért az ott bemutatott adatok csak az általános (verapamil gátláson alapuló) MDR aktivitás faktor értékekre alapulnak. Viszont annak demonstrálására, hogy a módszer alkalmas arra, hogy akár klinikai mintákban is detektáljuk az MRP1 aktivitást, a 8e ábrán egy esettanulmányt mutatok be. Egy akut mieloid leukémiában szenvedő beteg perifériás véréből mononukleáris sejteket izoláltunk, majd a sejtmintán szelektív (MK571-t és verapamilt alkalmazó) calcein asssay-t végeztünk. Mivel ebben a bemutatott esetben az MK571 ugyanolyan mértékben gátolta a festékeltávolítást, mint a verapamil, az valószínű-síthető, hogy az adott beteg sejtjeiben MRP1 expresszálódik, de MDR1 nem.

9. ábra: Az MDR1-et, illetve MRP1-et expresszáló sejtek elkülönítése egy-sejt szinten. HL60 MRP és 3T3 MDR sejteket tartalmazó kevert tenyészetet 0,25 µM calcein AM-mel inkubáltuk, majd a jelzett időpontban 50 µM benzbromaront, majd 50 µM verapamilt adtunk a médiumhoz. A sejtekben a calcein felhalmozódást fluoreszcens képalkotó rendszerrel vizsgáltuk. a) A DIC felvételen kiválasztottunk néhány sejtet. b) Az egyes sejtekre helyezett régiókkal (ROI: region of interest) meghatároztuk a festékfelvételi kinetikát. A benzbromaron gátlóhatása alapján az MRP1-et kifejező sejtek megkülönböztethetőek az MDR1-et expresszálóktól.

Az MDR1 és MRP1 aktivitásának az előzőekben bemutatott, calcein assay-vel történő megkülönböztetése nemcsak áramlási citométerrel lehetséges, hanem fluoreszcens mikroszkóp és ahhoz csatlakozó képalkotó rendszer segítségével akár az egyes sejtek szintjén is alkalmazható a módszer. Ennek bemutatására összekevertünk HL60 MRP és 3T3 MDR sejteket, és a calcein AM hozzáadását követően mikroszkópos rendszerrel követtük a fluoreszcencia felhalmozódását az egyes sejtekben (9. ábra). Ebben az esetben benzbromaront használtunk MRP1-szelektív gátlószerként. A 9b ábrán bemutatott festékfelvételi kinetikákból látható, hogy a tetszőlegesen kiválasztott 5 sejt közül kettőben növekedett meg a festék-felvétel sebessége, a másik háromban csak a verapamil hozzáadása után tapasztaltuk ezt, ami arra utal, hogy ezekben a sejtekben az MDR1 expresszálódik. A látómezőt rögzítve és a sejteket fixálva, immunfestéssel igazoltuk abban a három sejtben az MDR1 jelenlétét (ábrán nem bemutatott eredmény, 2. közlemény 4. ábra).

A fent ismertetett munkában megmutattuk, hogy a calcein assay alkalmas mind az MDR1, mind az MRP1 aktivitásának detektálására. Szelektív gátlószer alkalmazásával heterogén kultúrákban pedig megkülönböztethetők az egyik vagy másik multidrog transzportert expresszáló sejtpopulációk vagy akár egyes sejtek. Bár az itt bemutatott példákban ilyen eset nem fordult elő, de olyan is előfordulhat, hogy egy sejt expresszálja mindkét transzportert, módszerünk azonban alkalmas ennek detektálására is.

4.1.3. A calcein assay diagnosztikai alkalmazása