Az ABCG2 multidrog transzporter GFP-vel való címkézése

A fehérjék funkcionális tanulmányozására egyre szélesebb körben elterjedt módszer egy fluoreszcens protein (GFP, YFP, mCherry, stb.) kovalens kapcsolása a vizsgálandó objektum-hoz. Ezek a fúziós fehérjék lehetőséget nyújtanak a sejtben zajló dinamikus folyamatok közvetlen tanulmányozására, mint például a sejten belüli trafficking vagy a szubcelluláris lokalizáció megváltozása. Az ABC transzporterek sejtbiológiai vizsgálatára is kiváló lehetőséget nyújtana egy ilyen konstrukció, azonban az ABC fehérjék speciális feltekeredése, a doménok szigorú elrendeződése és funkcionális együttműködése rendkívül érzékennyé teszi ezeket a transzportereket az ilyenfajta beavatkozásokra, amelyet sok más fehérjénél rutin-szerűen alkalmaznak. Sokszor egy kisebb epitóp tag bevitele is jelentősen befolyásolja az ABC transzporter aktivitását, érését, sejten belüli elhelyezkedését. A következőkben arról a munkánkról számolok be, aminek eredményeképpen – számos sikertelen próbálkozás után – létrehoztunk egy olyan zöld fluoreszcens proteinnel (GFP-vel) fuzionáltatott ABCG2 fehérjét, amely teljes mértékben megőrizte minden fontos tulajdonságát, további lehetőségeket kínálva az ABCG2 részletes funkcionális vizsgálatára.

Az ABCG2 GFP-vel való címkézésére többféle konstrukciót készítettünk. Kritikusnak bizonyult, hogy a fehérje C-terminálisa érintetlen maradjon. Amennyiben a transzportert ezen a végén fuzionáltattuk a GFP-vel, akkor az instabil, intracelluláris kompartmentekben maradó és funkció-vesztett fehérjét eredményezett. Az N-terminálisan címkézett konstrukciók esetében is fontos volt a megfelelő linker régió közbeiktatása (17. ábra). A korábban használt inaktív mutáns (ABCG2K86M) GFP-vel fuzionáltatott változatát is elkészítettük (GFP-G2KM).

17. ábra: A GFP-vel címkézett ABCG2 szerkezete. NBD: nukleotid-kötő domén, TMD: transzmembrán do-mén. Az ábra alján a GFP és a fehérje közötti linker régió aminosav-sorrendje kiemelve látható. A KM és a nyíl a funkcionális vizsgálatok kontrolljaként használt mutáns változatban lévő lizin-metionin csere pozícióját jelöli.

Elvégeztük a GFP címkével ellátott ABCG2 (GFP-G2) részletes elemzését, a kapott eredményeket minden esetben a címke nélküli, vad típusú fehérjével (G2) hasonlítva össze.

Western analízis egyértelműen megmutatta a két fehérje molekulatömege közötti különbséget, és demonstrálta a GFP-G2 fehérje stabilitását is (18a ábra). A vanadát-szenzitív ATPáz aktivitást mérve, a fúziós fehérje az eredeti transzporterrel egyenrangúnak bizonyult mind az alap-, mind stimulált aktivitás tekintetében (18b ábra). A mérés specifikusságát a drog-szubsztrát mellé adott Ko143 inhibitor alkalmazásával igazoltuk.

18. ábra: A GFP-G2 expressziója és funkcionális jellemzése. a) ABCG2-specifikus monoklonális ellen-anyaggal (BXP21) készült Western analízis vad típusú (G2), illetve GFP-vel címkézett (GFP-G2) ABCG2-t tartalmazó Sf9 membránpreparátumokon. b-c) Szubsztrát-stimulált APTáz aktivitás, illetve metotrexát vezikuláris transzport mérés ugyanezeken a mintákon. Jelölések: +C: koleszterintöltés, EKI: 1 μM EKI-785 (tirozinkináz inhibitor) KO: 1 μM EKI-785 + 1 μM Ko143 (ABCG2-specifikus gátlószer). Az oszlopdiagramok átlag ± SEM (n = 3) értékeket tüntetnek fel. A transzportmérésnél az eredményeket a vad típusú ABCG2-vel, koleszterintöltés nélkül kapott aktivitásra normalizáltuk. d-e) A glikoziláció és dimerképződés vizsgálata Western analízissel BXP21 ellenanyaggal G2-t, illetve GFPG2-t tartalmazó Sf9 membránokon, illetve HEK293 sejtlizátumokon. A dimerizáció vizsgálatához szintén HEK293 sejtekből preparáltunk mintákat redukáló (R), illetve nem-redukáló (NR) körülmények között.

Az előző fejezetben részletesen bemutattam, hogy az ABCG2 funkcióját jelentősen befolyásolja a membránok koleszterin tartalma. Azokat az eredményeket viszont a disszertációban nem ismertettem, amelyek azt demonstrálják, hogy az ABCG2 egy természetes előfordulású pontmutációt hordozó (R482G) változata nem mutat koleszterin-függést [5. sz. közlemény]. Ezek alapján indokolt volt a GFP-vel címkézett változat aktivitásának a koleszterintartalomtól való függését is megvizsgálni. Azt tapasztaltuk, hogy a koleszterin a vad típusú fehérjéhez teljesen hasonló módon fokozza GFP-címkézett ABCG2 aktivitását (18b ábra). Hasonlóképpen egyformának mutatkozott a címkézett és címkézetlen ABCG2 a kifordított vezikulákon mért drogtranszport (metotrexát felvétel) tekintetében is (18c ábra). A drogtranszportok koleszterin-függése is megegyezett.

Ismeretes, hogy az ABCG2 a legutolsó, a C-terminálisához legközelebb eső külső hurkon glikozilálódik [96]. Ha emlős glikoproteineket Sf9 rovarsejtes heterológ expressziós rendszerben termeltetünk, a fehérje glikozilációja csak részben megy végbe (ún. core glikoziláció). Ezért a glikoziláció ellenőrzésének egyik legegyszerűbb módja, ha a vizsgált fehérjét mind rovarsejtes, mind emlős expressziós rendszerben kifejeztetjük, és a két minta elektroforetikus migrációs tulajdonságait összehasonlítjuk. Eredményeink megmutatták, hogy a GFP-G2 a vad típusú fehérjéhez teljesen hasonlóan glikozilálódik (18d ábra). Bár ez a módosítás a fehérje normális lokalizációjához és funkciójához nem feltétlenül szükséges [97], de tükrözi a fehérje megfelelő érését és a plazmamembránba történő célbajuttatását (tageting-jét).

Korábban szó esett arról, hogy az ABCG2 homodimerként működik. Kritikus kérdés volt, hogy a GFP-vel való címkézés érinti-e a dimerképzést. Ezért redukáló és nem-redukáló körülmények között is preparáltunk mintákat GFP-G2-t, illetve vad típusú G2-t expresszáló HEK293 sejtekből. Western blot analízissel sikerült kimutatnunk, hogy a GFP-G2 a címkézetlen fehérjéhez hasonlóan dimerizálódik (18e ábra). Hasonlóképpen immun-fluoreszcens festéssel és konfokális mikroszkópos vizsgálattal ellenőriztük a GFP-G2, valamint a GFP-G2KM sejten belüli elhelyezkedését, és azt tapasztaltuk, hogy a címkézett változatok ugyanúgy, mint a címkézetlenek elsősorban a plazmamembránban helyezkednek el (ábrán nem bemutatott eredmény, 6. közlemény, 2. ábra). Az ABCG2-nek egy jellegzetessége, hogy konformáció-függő módon jelölhető az 5D3 felszíni antitesttel (5D3-shift) [98]. Szintén kimutattuk, hogy a GFP-vel ellátott ABCG2 az 5D3 ellenanyaggal történt jelölését- a címkézetlen fehérjéhez hasonló mértékben - fokozza az enyhe paraformaldehiddel történő fixálás vagy az ABCG2 inhibitorok (Ko143, FTC) alkalmazása [6. közlemény, 3. ábra].

A GFP-vel ellátott ABCG2 alkalmazásának legnagyobb előnyét az jelenti, hogy a GFP címke lehetővé teszi az ABCG2 expressziójának követését és funkciójának közvetlen vizsgálatát akár kevert sejtkultúrákban is. Ez különösen kedvező lehet nehezen transz-fektálható, a klónozást nehezen toleráló vagy a drog-szelekcióra érzékeny sejttípusok tanul-mányozásakor. További előnyt jelent az is, hogy a transzfekciót követő rövid időn belül, a hosszadalmas klónozási és szelekciós eljárások elhagyásával végezhetők el ezek a vizsgálatok.

A következőkben a GFP-G2 ilyen irányú felhasználásának lehetőségét mutatom be.

Az előző két fejezetben már ismertettem a festék kipumpáláson alapuló fluoreszcens módszer, a transzport assay lényegét. A 19. ábrán bemutatott kísérletben is ezt a DNS festéket használtuk. Konfokális mikroszkóp segítségével követtük a Hoechst 33342 celluláris akkumulációját a GFP-címkézett ABCG2-vel tranziensen transzfektált HEK293 sejtekben 48 órával a transzfekciót követően. A festék ABCG2-függő kipumpálását - a szokásos módon -, ABCG2-specifikus gátlószer (1 μM Ko143) hozzáadásával függesztettük fel. A GFP fluoreszcenciája lehetőséget adott a sejtkultúrában a transzfektált sejtek azonosítására, így két külön csoportot képezve határoztuk meg a GFP-pozitív és a GFP-negatív sejtekben a festékfelvétel kinetikáját (19b ábra). A GFP-G2-t expresszáló sejtekben a transzporter hatékonyan megakadályozta a Hoechst bejutását, míg a kontroll (nem-transzfektált) sejtekben a festék gyors akkumulációját figyelhettük meg (19a ábra, felső, középső panel). A gátlószer hozzáadása után a transzfektált sejtekbe is bejutott a DNS-festék, fluoreszcenssé téve azok sejtmagját is (jobb panel). A 19b ábra mutatja a GFP-pozitív és -negatív sejtek nukleáris régiójában mért festékfelvétel kinetikáját. Hasonló kísérletet végeztünk a GFP-címkézett inaktív mutáns ABCG2 variánssal (GFP-G2KM-mel) transzfektált sejtekkel is (19a-b ábra, alsó panelek). Ebben az esetben mind a transzfektált, mind a nem-transzfektált sejtekben hasonló kinetikájú, gyors festékakkumulációt figyelhettünk meg, megerősítve azt, hogy az ABCG2 transzportaktivitása felelős az előzőekben tapasztalt Hoechst-felvétel megakadályozásáért.

Ezt a kísérleti összeállítást használva, vad típusú GFP-G2-t expresszáló sejteken vizsgáltuk a koleszterin tartalom hatását az ABCG2 festékeltávolító aktivitására. Az előző fejezetben részletesen ismertetett, korábbi eredményeinkkel összhangban a ciklodextrin (CD) kezeléssel történt koleszterin depléció csökkentette, míg a koleszterinnel való töltés (CD/Kol) növelte a transzporter aktivitását (19c ábra). Érdekes megfigyelés, hogy a koleszterinszint emelkedésével a festék penetrációja is csökkent. Ahogy azt a calcein assay kapcsán részletesen tárgyaltuk, az aktivitás faktor képes kiküszöbölni ezeket az aspecifikus hatásokat.

Így szoros összefüggést találtunk az enzimatikus úton meghatározott koleszterintartalom és a GFP-G2 aktivitás faktorral kifejezett transzportaktivitása között (19c ábra, jobb panel).

19. ábra: Fluoreszcens festékfelvétel mérése GFP-G2-t expresszáló ép sejteken. Tranziens transzfekcióval kapott HEK293 sejteken vizsgáltuk a GFP-G2, illetve annak mutáns változatának (GFP-G2KM) transzport-aktivitását Hoechst 33342 festéket (2 μM) használva. Az ABCG2 transzport-aktivitását kb. 3 perccel a Hoechst hozzáadása után 1 μM Ko143 alkalmazásával függesztettük fel (KO). a) Konfokális felvételek, melyek a festék addíciója előtt (bal oldali), közvetlenül a KO hozzáadását megelőzően (középső), illetve 2-3 perccel azután (jobb oldali panelek) készültek. b) Festékfelvételi kinetikai görbék, melyeket az a) panelen bemutatott kísérletek alapján 6-6 transzfektált (nem szaggatott), illetve nem-transzfektált (szaggatott) sejtmagi régiójában mért fluoreszcencia értékek átlagából határoztuk meg. c) Hoechst akkumuláció mérése kezeletlen („), 2,5 mM (‘), illetve 5 mM (S) ciklodextrinnel (CD), valamint 2,5 mM koleszterin-töltött ciklodextrinnel (CD/Kol, c) kezelt, GFP-G2-t expresszáló HEK293 sejtekben. A bal oldali panel a festékfelvételi görbéket mutatja, míg a jobb oldalon az azokból számolt aktivitás faktor és az enzimatikus úton meghatározott koleszterinszint korrelációja látható. Az ábrán feltüntetett eredmények átlag ± SEM értékeket tükröznek (n > 3).

Hasonló kísérletet végeztünk áramlási citométerrel is mitoxantron-transzportot mérve.

Ebben az esetben a transzfektált sejteket a GFP fluoreszcencia alapján végzett kapuzással különítettük el a nem-transzfektálódott sejtektől, így ezzel a módszerrel is megbízhatóan tudtuk mérni az ABCG2-függő drogtranszportot [6. közlemény, 3. ábra].

Összefoglalva, ebben a fejezetben bemutattuk, hogy az ABCG2 multidrog transzporter GFP-vel való címkézésével a fehérje legfőbb jellemvonásai teljes mértékben megőrződtek, valamint demonstráltuk a GFP-címkézett ABCG2 alkalmazásában rejlő lehetőségeket.

4.2.4. Az ABCG2 transzportmechanizmusának vizsgálata