Az ABCG2 transzportmechanizmusának vizsgálata

A membrántranszporterek többsége – az enzimekhez hasonlóan - egyfajta szubsztrát-specifitással rendelkezik, azaz egy vagy néhány molekulát képesek megkötni egy jól meghatározott szubsztrát-kötőhelyen. A szubsztrát-felismerést követően a transzporterek a megkötött vegyületet transzlokálják a membrán egyik oldaláról a másikra, amit egy elenge-dési lépés követ. Ez a klasszikus mechanizmus több tekintetben nehezen hozható összhangba a multidrog transzporterek aktivitásával. Ahogy arról korábban szó esett, az MDR-ABC fehérjék egyik legjellegzetesebb vonása a promiszkuitás, vagyis hogy rendkívül széles szubsztrát-felismerő képességgel rendelkeznek. A szubsztrátmolekulák sem kémiailag, sem szerkezetileg, de még méretben sem mutatnak hasonlóságot. Jellemző azonban, hogy sok hidrofób karakterű, illetve amfipatikus vegyületet találunk közöttük.

Mivel a hidrofób molekulák a lipid fázisban jól oldódnak, és megoszlás következtében magas koncentrációt érnek el a membránban, a fenti „klasszikus pumpa” mechanizmussal szemben az MDR-ABC fehérjék működésének magyarázatára alternatív modelleket javasoltak (20. ábra). Mindkettő lényege, hogy a szubsztrátfelismerés a lipid fázisban történik.

A „hidrofób porszívó” modell értelmében a multidrog transzporter közvetlenül a membránból pumpálja ki a transzportált szubsztrátot az extracelluláris térbe [99, 100]. A másik elképzelés szerint a transzporter floppázként működik, azaz a transzportált szubsztrátot átfordítja a sejtmembrán belső lipid rétegéből a külsőbe [101, 102]. A membránban létrehozott és folyamatosan fenntartott egyenlőtlen eloszlás - a vizes fázisokkal történő megoszlásokkal együtt a molekula nettó kiáramlását eredményezi.

20. ábra: A multidrog transzporterek működési mechanizmusára javasolt modellek. A klasszikus pumpa a citoplazmából a külső térbe helyezi át a transzportált szubsztrátot, ezzel szemben a hidrofób porszívó mecha-nizmussal működő transzporter közvetlenül a lipid kettősrétegből pumpálja ki a hidrofób karakterű szubsztrátot.

A floppáz a belső membránrétegből a külsőbe fordítja át a molekulákat, ezzel idézve elő azok nettó kiáramlását.

Ezek az alternatív modellek a multidrog transzporterek promiszkuitását is a lipid fázisban történő hidrofób kölcsönhatásra vezetik vissza, amely kevésbé specifikus, mint egy vizes fázisban létrejövő, hidrogénhidakon és egyéb erős molekuláris kölcsönhatásokon alapuló kapcsolat. Bár számos erőfeszítést tettek az alternatív transzportmodellek kísérletes igazolására, eddig csak közvetett eredmények születtek. A transzportált szubsztrátokkal történt affinitás-jelöléssel a transzporter membránba ágyazott felülete rajzolódik ki [103-106].

Jól definiált drog-kötőhely nem látszik ezekből az eredményekből, ami összhangban áll a gyenge hidrofób kölcsönhatásokra épülő transzporter-szubsztrát kapcsolat hipotézisével.

Néhány, jelölt molekulákkal membránvezikulákon végzett funkcionális vizsgálat is arra utal, hogy a transzporter a lipid fázisból pumpálja ki a szubsztrát molekulát [107, 108].

Érdekes módon egy, a témával foglalkozó átfogó közlemény a calcein assay alapját képező korábbi felfedezésünket is az alternatív modelleket megerősítő kísérletes adatok közé sorolja [101]. A fluoreszcens acetoxi-metilészterekkel végzett munkánk megmutatta, hogy megfelelően magas MDR1 expresszió mellett csak minimális észterhasítás történik a sejtekben. Ez – az említett közlemény szerint – azt mutatja, hogy a transzporter kipumpálja a sejtből a szubsztrátot mielőtt az elérné a citoplazmát. Véleményem szerint eredményeinkből ez a következtetés nem vonható le, ugyanis ha a transzporter - az észterázok affinitásához és aktivitásához képest - kellően nagy affinitással és transzportkapacitással rendelkezik, akkor is tapasztalhatunk ilyen csekély festékfelhalmozódást a sejtekben.

A következőkben ismertetett munkánkban az ABCG2 multidrog transzporter működési mechanizmusát vizsgáltuk a fehérje GFP-vel címkézett változatát (GFP-G2) alkalmazva.

Ezekben a tanulmányokban olyan ABCG2 szubsztrátokat használtunk, mint a mitoxantron (MX) vagy a feoforbid A (feoA), melyek azzal a különleges tulajdonsággal bírnak, hogy a lipid környezetben a fluoreszcenciájuk nagyságrendekkel megnő [109, 110]. Kimutattuk, hogy a 19. ábrán bemutatott kísérletekhez hasonlóan on-line konfokális elemzéssel az ABCG2 transzportaktivitása megbízhatóan meghatározható. A Hoechst transzport assay-vel ellentétben ezekben a tanulmányokban nem a sejtmagokban mértük a festék celluláris felhal-mozódását, hanem az intracelluláris membránokban, ahol a MX és a feoA fluoreszcenssé válik (ábrán nem bemutatott eredmény, 7. közlemény 1. ábra). Azt is demonstráltuk, hogy a GFP-G2 drog-eltávolító aktivitása az expressziós szinttől függ. Hasonló összefüggést mutattunk ki a MX akkumulációval meghatározott aktivitás faktor és a GFP fluoreszcencia alapján becsült expressziós szint között, mint amit korábbi munkáinkban az MDR1 expressziója és a calcein assay-vel meghatározott aktivitásfaktorral kaptunk (ábrán nem bemutatott eredmény, 7. közlemény 2. ábra).

21. ábra: A mitoxantron plazmamembrán akkumulációjának mennyiségi meghatározása. a-f) A GFP-G2-t expresszáló HEK293 sejtekkel készült konfokális mikroszkópos felvételsorozaton a felső panelek a GFP fluoreszcenciát, míg az alsó panelek a mitoxantron (MX) távoli vörös fluoreszcenciáját mutatják. A képek fölötti számok a 2 μM MX addíciójától számított időt mutatják másodpercben kifejezve. A jobb oldali panelek az ABCG2-specifikus gátlószer (KO: 1 μM Ko143) hozzáadása után készültek. A skála 5 μm-t jelöl. g) A plazma-membrán pozícióját a GFP fluoreszcencia alapján követtük egy régióval (ROI-val) (S, GFP). Ugyanazt a ROI-t használva meghatároztuk a mitoxantron fluoreszcenciáját a plazmamembránban („, MXmem), illetve közvetlenül a membrán alatti régióban (z, MXintra). h-i) GFP-G2-t, illetve GFP-G2KM-et expresszáló sejtekben a mitoxantron akkumulációja a plazmamembránban (mem), illetve a membrán alatti régióban (intra). A teli szimbólumok a transzfektált sejteket (tr), míg az üresek a kontroll, azaz nem-transzfektált (non-tr) sejteket jelölik.

Az utóbbi két panelen legalább 4 független kísérletből kapott átlag ± SEM értékek vannak feltüntetve.

Ezekben a kísérletekben megfigyeltük, hogy a MX-t vagy a feoA-t a sejtekhez adva, a fluoreszcencia növekedése nemcsak az intracelluláris membránokban tapasztalható, hanem a sejtmembránok is világosan kirajzolódnak (21a-f ábrák). Az ABCG2 fehérjéhez kapcsolt GFP-címke lehetőséget adott arra, hogy nyomon kövessük a plazmamembrán változó pozícióját, és így meghatározzuk a drog plazmamembránban történő akkumulációjának kinetikáját (21g ábra). Ezzel párhuzamosan közvetlenül a sejtmembrán alatti régióban követtük a drog intracelluláris felhalmozódását is. Azt tapasztaltuk, hogy a plazma-membránban a drog koncentráció hamar telítésbe hajlik, míg a sejten belül csak lassan, de fokozatosan emelkedik. Az ABCG2-specifikus gátlószer (Ko143) hozzáadása után mindkét

kompartmentben meredek fluoreszcencia emelkedést figyelhettünk meg (21f-g ábra), ami arra utal, hogy a tapasztalt jelenség az ABCG2 transzportaktivitásának következménye.

A tranziens transzfekciós rendszer, valamint a GFP-címkézett transzporter lehetőséget adott arra, hogy egy látómezőben párhuzamosan kövessük nyomon a drogfelvételt a transzgént expresszáló és a kontroll (nem-transzfektált) sejtekben. Összevetettük a drogfelvétel kinetikáját kontroll sejtekben, GFP-címkézett ABCG2 vad típusú (GFP-G2), illetve annak inaktív mutáns variánsát (GFP-G2KM) expresszáló sejtekben - mind a plazmamembránt, mind a szubmembrán régiót tekintve. Azt tapasztaltuk, hogy a plazma-membrán drog koncentrációjának gyors telítésbe hajlása sem a kontroll, sem a GFP-G2KM-t expresszáló sejtekre nem jellemző (21h-g ábra), tovább megerősítve azt a feltételezést, hogy a vad típusú sejteknél tapasztalt kinetika az ABCG2 aktivitásának következménye.

22. ábra: A drog celluláris felvételét és kipumpálást leíró különböző kinetikai modellek. a) A drogfelvétel nem-transzfektált, kontroll sejtekbe (0 modell) b) A klasszikus pumpa mechanizmusnak megfelelő séma (A modell), melyben a transzportált szubsztrát a citoplazmából a külső térbe transzlokálódik. c) Egy alternatív modell, melyben a szubsztrátot közvetlenül a plazmamembránból pumpálja ki a transzporter. Jelölések:

c – koncentráció, k – sebességi állandó, V – térfogat; indexek: e – külső, m – plazmamembrán, i – intracelluláris.

d-f) A kinetikai modellek zárt alakú parametrikus megoldásai. Szaggatott vonal: nem transzfektált (non-tr), folytonos vonal: transzfektált (tr) sejtek (tr); vastag vonal: plazmamembrán (mem); vékony vonal: intracelluláris (intra) koncentráció. Az inhibitor hozzáadását úgy modelleztük, hogy 300 másodpercnél a k3 paramétert nullával tettük egyenlővé.

A drog celluláris felvételének, illetve kipumpálásának leírására különböző transzport-kinetikai modelleket alkottunk (22. ábra). A transzporter nélküli helyzetet, azaz a kontroll sejtekbe történő drog akkumulációt a „0 modell” segítségével, míg a transzportert expresszáló sejtekben a drog eloszlását két különböző, „A”, illetve „B” modellel írtuk le. Az előbbi a

„klasszikus pumpa” mechanizmusnak feleltethető meg, míg az utóbbiban a transzporter a szubsztrátot közvetlenül a membránból pumpálja ki, nem meghatározva a szubsztrát-felismerés pontos helyét. A „B” modell ezért tulajdonképpen egyesíti magában a „hidrofób porszívó” és a „floppáz” modelleket.

A transzportfolyamatok ilyenfajta leírása számos egyszerűsítést és feltételezést foglal magában. Egyrészt első közelítésben a membránt egy egységes kompartmentnek tekintettük, ezzel áttételesen feltételeztük azt, hogy a membránon belüli diffúzió és/vagy flip-flop mozgás nem sebesség-meghatározó lépés. Ezt a mitoxantron fizikai-kémiai tulajdonságai alapján tehettük meg, hiszen a lipid/víz megoszlási hányadosa 230 000. További egyszerűsítés, hogy a pumpa által képviselt transzportlépést – a többi lépéshez hasonlóan - elsőrendű kinetikával írtuk le, arra alapozva, hogy az adott drogkoncentráció a Km alatti tartományba esik. A 22a-c ábrákon bemutatott sémákat egy-egy differenciál-egyenletrendszerrel írtuk le. Ezekben éltünk még egy feltételezéssel, nevezetesen, hogy a külső drog koncentráció az adott idő keretben állandó. Ezt az alapján tehettük meg, hogy a külső tér nagyságrendileg nagyobb a sejtek és a sejtmembránok térfogatánál. A differenciál-egyenletrendszerek zártalakú megoldásakor azt is feltételeztük, hogy k2 = k-2 azzal a megfontolással, hogy két lipid fázis közötti átmenetet írunk le ezekkel a lépésekkel, hiszen a kísérletekben a plazmamembránban és a belső membránok-ban határozzuk meg a drogkoncentrációt.

A differenciál-egyenletrendszerek parametrikus megoldása alapján több kvalitatív megállapítást tehettünk a modellek viselkedésére vonatkozóan. 1.) Az „A” modellben a drog plazmamembrán koncentrációja (cm) csak kevéssé tér el a kontroll sejtekben mért értékektől, csak lassan éri el az egyensúlyi koncentrációt, ezzel szemben a „B” modell alapján cm

hamarosan egyensúlyba jut. 2.) A membrán (cm) és az intracelluláris (ci) drogkoncentráció az

„A” modellben különböző értéket vesz fel egyensúlyban, míg a „B” modellben azonos érték felé tartanak. 3.) A gátlószer hozzáadása után az „A” modellben ci növekedése indul meg gyorsan, amit a cm emelkedése lassan követ, míg a „B” modellben éppen fordított a helyzet.

4.) Az is megállapítható – akár egyszerű logikai megfontolás alapján is -, hogy ha a droggal előzetesen megtöltött sejtekből a drogkiáramlást mérjük, akkor abból a kompartmentben csökken a koncentráció hamarább, ahonnan a transzporter kipumpálja a vegyületet. Ezeket a megállapításokat matematikailag is igazoltuk (7. sz. közlemény, függelék).

23. ábra: A drogfelvétel kísérleti adatainak és a modell predikciók összevetése. a) GFP-G2-t expresszáló (tr), illetve nem-transzfektált (non-tr) sejtekben a mitoxantron plazmamembránba („, …, mem) és a membrán alatti régióba (z, {, intra) történő akkumulációjának kísérletileg meghatározott kinetikája (n > 4). A szaggatott vonalak a kontroll sejtekben mért cm és ci értékeihez a „0 modell” alapján illesztett görbéket jelölik, míg a folytonos vonalak ugyanezt reprezentálják a GFP-G2-t expresszáló sejtekben a „B” modellt alapul véve. Vastag vonal: plazmamembrán (mem); vékony vonal: intracelluláris (intra) koncentráció. b) A drogfelvétel egyensúlyi értékeinek meghatározása GFP-G2-t expresszáló sejtek plazmamembránjában („, trmem), illetve a szubmembrán régióban (z,trintra) mérve. c) A drogkiáramlás kinetikája mitoxantronnal előzetesen feltöltött sejtekből.

A jelölések ugyanazok, mint az előző panelen.

Kísérleti adataink minden tekintetben a „B” modellt igazolták vissza, mivel cm – mint ahogy azt korábban megállapítottuk - gyorsan telítődik (23a ábra), cm és ci azonos egyensúlyi érték felé konvergálnak (23b ábra), a Ko143 addícióját követően cm növekedése indul meg gyorsan (23a ábra), és végül az efflux kísérletben a plazmamembránból indul meg a a drog kiáramlása először (23c ábra). Az is belátható, hogy a „B” modell esetében 1/cm egyensúlyi értéke lineáris összefüggést mutat k3-mal, ami arányos az expressziós szinttel. Kísérleti adataink visszaigazolták a lineáris kapcsolatot az egyensúlyi 1/cm értékek és a GFP fluoreszcencia között (ábrán nem bemutatott eredmény, 7. közlemény 5f ábra).

Egy további megközelítésben a kísérleteinkben meghatározott cm és ci értékekre kineti-kai görbéket illesztettük a különböző modellek alapján. Először a kontroll sejtekbe történő passzív drogfelvétel időgörbéjével végeztünk paraméterillesztést a legkisebb négyzetek módszerét használva (23a ábra, szaggatott vonalak). Érdemes megjegyezni, hogy ez a numeri-kus megközelítés is visszaigazolta a zártalakú megoldáskor tett feltételezésünket, miszerint k2 = k-2. Ezt követően a kontroll sejtek adataival kapott illesztés paramétereit rögzítve, a GFP-G2-t expresszáló sejtekkel kapott kísérleti értékekhez illesztettünk görbét k3–mal, mint egyet-len szabad paraméterrel, mind az „A”, mind a „B” modellt alapul véve. Az előbbi esetében nem kaptunk elfogadható illeszkedést (RMSE = 652,1), a „B” modellt használva viszont jó volt a kísérleti adatokhoz való illeszkedés (RMSE = 38,1) (23a ábra, folytonos vonalak).

Ezen felül alkottunk olyan transzportsémákat is, melyekben a membrán külső és belső rétege külön kompartmentet képez (7. közlemény 6. ábra). Ez a megközelítés egyrészt nem él azzal a feltételezéssel, hogy a membránon belüli tranzíció gyors folyamat, másrészt lehetőséget teremt a „hidrofób porszívó” és a „floppáz” modell megkülönböztetésére. Ezeket a sémákat leíró differenciál-egyenletrendszerek numerikus megoldása megmutatta, hogy az előbb említett feltételezés megalapozott volt. Másrészt szintén azt eredményezte, hogy a

„klasszikus pumpa” modellhez való illesztés elfogadhatatlan. A másik két transzportmodellel viszonylag jó illeszkedést kaptunk, azonban azok közül a „floppáz” mechanizmust feltételező modell bizonyult jobbnak.

Összefoglalva, eredményeink megmutatták, hogy egy kulcsfontosságú multidrog transzporter, az ABCG2 az egyik legfontosabb drog-szubsztrátját, a mitoxantront nem a klasszikus mechanizmus révén transzportálja, hanem közvetlenül a membránból pumpálja ki a sejtből. Eredményeink ugyan valamelyest a „floppáz” modellt részesítik előnyben, azonban a kísérleteinkből nem vonható le olyan következtetés, amely a „hidrofób porszívó” modellt elvetné, viszont azt egyértelműen valószínűsítik, hogy a szubsztrátfelismerés a lipid fázisban történik. Meg kell jegyezni azonban azt is, hogy nem szabad általánosítani ezekből az eredményekből, hiszen ismeretes, hogy például az MRP1 többféle transzportmechanizmussal képes a különböző szubsztrátmolekulákat kezelni. Elképzelhető, hogy az ABCG2 is a kevésbé hidrofób szubsztrátjait (pl. a topotekánt) a klasszikus mechanizmussal transzportálja.

Mindenestre a mostani eredményeink fontos adalékot jelenthetnek egy hosszú évekre visszanyúló tudományos vitához, és egyedülálló módon, ép sejteken végzett transzport-kísérletekkel igazolják az elméleti megfontolásokkal felállított alternatív transzportmodellek érvényességét.