A membrán koleszterintartalmának hatása az ABCG2 aktivitására

Az ABCG2 funkcionális szabályozásáról ma még viszonylag keveset tudunk.

Valamennyi ismerettel rendelkezünk az ABCG2 transzkripcióját befolyásoló tényezőkről.

Ismeretes, hogy citotoxikus szerek, a hipoxia és bizonyos hormonok befolyásolják az ABCG2 átíródását [81, 92, 93]. Arról is beszámoltak már, hogy az öszrogén poszt-transzlációs módosítás révén csökkenti az érett ABCG2 celluláris mennyiségét [94]. A membránok koleszterintartalma számos membránfehérje – többek között ABC transzporterek - funkcióját képes befolyásolni. Különös szereppel bírnak ebben a tekintetben a membránok magas koleszterin-tartalmú mikrodoménjei. Egy korábbi tanulmány beszámolt arról, hogy az ABCG2 ATPáz aktivitását stimulálja a koleszterin [95]. Mivel a transzportált szubsztrátok legtöbbször fokozzák az ABC transzporterek ATPáz aktivitását [8], a szerzők azt a következtetést vonták le, hogy az ABCG2 közvetlenül részt vehet a koleszterintranszportban.

Ennek közvetlen igazolására azonban nem került sor. A következőkben bemutatott munkánkban a koleszterin ABCG2 aktivitására gyakorolt hatását vizsgáltuk meg.

A korábbiakban sikerrel alkalmazott Sf9 rovarsejtes heterológ expressziós rendszer segítségével az ABCG2 fehérjét tartalmazó membránpreparátumokon azt tapasztaltuk , hogy a drog-stimulált ATPáz aktivitást a membránok koleszterinnel való feltöltése jelentősen fokozza – még olyan vegyületek esetében is, amelyek máskülönben csak csekély mértékben stimulálják az ABCG2 ATPáz aktivitását (ábrán nem bemutatott eredmény). Fontos megjegyezni, hogy a rovarsejtek koleszterintartalma messze elmarad az emlős sejtek plazma-membránjának koleszterinszintjétől. Ezeknél a méréseknél a membránokhoz a koleszterin hozzáadását a preparálásnál alkalmazott koleszterinnel töltött random metilezett β-ciklodextrin (CD/Kol) segítségével végeztük. Érdemes megjegyezni azt is, hogy az alapaktivitást, azaz a kívülről hozzá adott szubsztrát nélkül tapasztalt aktivitást önmagában a koleszterin nem fokozta. Az ABCG2 viszonylag magas alap ATPáz aktivitással rendelkezik, amivel kapcsolatban két elképzelés él. Egyrészt szóba jöhet, hogy a fehérje ebben az expressziós rendszerben részben szétkapcsolt, azaz az ATPáz aktivitás és a transzport nincs teljesen összhangban, másrészt – többek által elfogadott nézet szerint – a preparátumban jelen lehet egy nem ismert endogén szubsztrát molekula. Ezért némileg meglepő, hogy a koleszterin nem fokozta az ABCG2 alap ATPáz aktivitását.

A következőkben arra kerestünk választ, hogy a koleszterin csak az ABCG2 által képviselt ATPáz aktvitást fokozza-e, vagy képes befolyásolni a transzportot is. Ennek a

kérdésnek a megválaszolásához első sorban emlős sejteket használtunk, és egy fordított megközelítést alkalmaztunk. Ebben az esetben nem növeltük a membránok koleszterin-tartalmát, hanem az emlős sejtek membránjának viszonylag magas koleszterinszintjét csökkentettük üres ciklodextrinnel (CD) történő előkezeléssel (depléció). Emellett persze koleszterin-tartalmú CD (CD/Kol) előkezeléssel megkíséreltük az emlős sejtekben tovább fokozni (töltés), illetve a koleszterin-depletált sejtekben helyreállítani a koleszterinszintet (repléció: CD+CD/Kol). Ezekhez a kísérletekhez az ABCG2-t stabilan expresszáló HEK293 sejteket (HEK/G2), illetve az előző fejezetben többször alkalmazott pikkelysejtes karcinóma sejteket (A431/G2) használtuk. Az ABCG2 transzportaktivitását a calcein assay-vel hasonló elvekre alapuló, a 12b ábra kapcsán már ismertetett Hoechst transzport méréssel határoztuk meg. Ennek lényege röviden, hogy a Hoechst 33342 fluoreszcens DNS festéket az ABCG2 hatékonyan kipumpálja a sejtekből, a transzportot specifikus ABCG2 gátlószerrel (Ko143-mal) felfüggesztve, a két kapott festékfelvételi sebességből meghatározhatjuk az ABCG2 transzportaktivitását (ld. 1. képlet). Vizsgálatainkat mind sejtszuszpenzióban (14. ábra), mind részletes konfokális mikroszkópos elemzéssel (15. ábra) elvégeztük.

14. ábra: A koleszterin depléció és koleszterin töltés hatása az ABCG2 transzportaktivitására ép sejtekben.

Az ABCG2-t expresszáló A431 (A431/G2) és HEK293 (HEK/G2) sejtekben, valamint az MDR1-et kifejező HEK293 sejtekben (HEK/MDR1) mértük a Hoechst 33342 fluoreszcens festék felvételét, majd az ABCG2-függő festék eltávolítást ABCG2-specifikus gátlószerrel (1 μM Ko143) függesztettük fel. Az eredményeket a festékfelvételi sebességekből számított aktivitás faktor értékkel (átlag + SD, n > 3) fejeztük ki (ld. „Alkalmazott módszerek”). A koleszterin depléciót közvetlenül a festékfelvételi kísérlet előtt végzett ciklodextrin (CD) kezeléssel (4 mM, 37 ˚C, 30 perc), míg a sejtek koleszterinnel való töltését ugyanilyen körülmények között végzett koleszterint tartalmazó CD (CD/Kol) előkezeléssel hajtottuk végre. A csíkozott oszlopok azt mutatják, amikor a CD-vel történt depléciót követően visszatöltöttük a sejteket koleszterinnel CD/Kol kezeléssel.

15. ábra: Az ABCG2-függő festéktranszport koleszterin-függésének konfokális mikroszkópos elemzése.

ABCG2-t expresszáló HEK293 sejteket ciklodextrinnel (CD), illetve koleszterin-töltött ciklodextrinnel (CD/Kol) előkezeltünk (2,5 mM, 37 ˚C, 20 perc), majd követtük a Hoechst 33342 (2 μM) akkumulációt. A bal oldali (a, c, e) paneleken kb. 2 perccel a festék hozzáadása után készült, reprezentatív konfokális képek láthatók, míg a jobb oldaliak (b, d, f) az ABCG2-gátlószer (Ko143) addíciója után 4 perccel készült felvételeket mutatnak.

g) A korábbi paneleken bemutatott kísérlet alapján készült, 12 sejt átlagából meghatározott festékfelvételi görbék.

h) Az előzőekhez hasonló, több független kísérlet eredményeként kapott ABCG2-függő aktivitás faktor értékek (átlag + SD, n > 3). A csillagok a kezeletlen sejtekkel kapott értékhez viszonyított szignifikáns eltérést jelölik.

Azt tapasztaltuk, hogy az emlős sejtek koleszterin depléciója nagymértékben gátolta az ABCG2 transzportaktivitását mindkét ABCG2-t expresszáló sejtvonalban, a koleszterintöltés viszont csak az A431/G2 sejtekben volt képes tovább fokozni a festék kipumpálását. A jelenség reverzibilitását igazolta, hogy a koleszterin-depletált sejtekben a repléció helyre-állította az eredeti transzportaktivitást. Összehasonlításképpen MDR1-et expresszáló HEK293 sejtekben (HEK/MDR1) is mértük a koleszterin-tartalom transzportra gyakorolt hatását. Ezt az összehasonlítást az teszi lehetővé, hogy a Hoechst 33342 az MDR1-nek is jó szubsztrátja, ebben az esetben azonban inhibitorként verapamilt használtunk. Eredményeink azt mutatták, hogy a sejtek koleszterintartalma nem befolyásolja az MDR1 transzportaktivitását.

Fontos megjegyezni, hogy az ABCG2-t nem expresszáló kontroll (HEK293 és A431) sejtekben mért aktivitás faktort nem befolyásolta sem a koleszterin depléció, sem a koleszterinnel való töltés, valamint hogy hasonló eredményekre jutottunk más fluoreszcens szubsztrát molekulák (mitoxantron, feoforbid A) alkalmazásával is. Enzimatikus koleszterin méréssel megállapítottuk, hogy a HEK293 sejtekben lévő eredeti koleszterin szint 7,7 ± 1,1 μg/teljes fehérje értékről a CD kezelés hatására (4 mM, 37 ˚C, 30 perc) kb. 25 %-kal (5,7 ± 0,9 μg/teljes fehérje értékre) csökkent. A koleszterinnel való töltés (CD/Kol) kb. 50 %-os emelkedést okozott (12,0 ± 1,2 μg/teljes fehérje). A fenti körülmények között végrehajtott ciklodextrin-kezelések érdemben nem csökkentették a sejtek életképességét, amit propidium-jodid (PI) festéssel állapítottunk meg (a PI negatív sejtek aránya: > 85 %).

16. ábra: A koleszterin depléció hatása az ABCG2 sejten belüli elhelyezkedésére. ABCG2-t expresszáló HEK293 sejteket - a 15. ábrán bemutatott kísérlethez hasonló módon - ciklodextrinnel (CD) kezeltük, majd immunfluoreszcens festést végeztünk extracelluláris epitópot felismerő ellenanyag (5D3) segítségével nem-permeabilizált sejteken (a, b), illetve intracelluláris epitóp ellen készült ellenanyag (BXP21) felhasználásával permeabilizált sejteken (c, d). Az immunfluoreszcens festés eredményét konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk.

Fontos volt tisztázni, hogy a koleszterin depléció következtében tapasztalt transzport-aktivitás csökkenés vajon a fehérje transzport-aktivitásának közvetlen modulálásából ered vagy pedig az ABCG2 sejtfelszíni expresszióját befolyásolja a membránok koleszterin tartalma. Ezért immunfluoreszcens festéssel ellenőriztük a CD-kezelés hatását az ABCG2 sejten belüli elhelyezkedésére HEK/G2 sejteken (16. ábra). A sejtfelszíni jelölést nem permeabilizált

sejteken végeztük extracelluláris epitópot felismerő, direkt jelölt ellenanyaggal (5D3), míg az ABCG2 lokalizációját az egész sejtben permeabilizált mintákon BXP21 ellenanyagot használva indirekt immunfestéssel vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy az ABCG2 elsődlegesen a sejtek plazmamembránjában helyezkedik el, és hogy ez a rövid idejű koleszterin depléció a fehérje lokalizációját sem a sejtfelszínen, sem a sejt egészét tekintve érdemben nem befolyásolja.

Az ép sejteken végzett kísérletek eredményét a későbbiekben megerősítettük közvetlen transzportmérésekkel is ABCG2-t tartalmazó Sf9 kifordított (inside out) membránvezikulákon.

Mind a metotrexát, mind az ösztradiol-glükoronid ATP-függő felvételét jelentős mértékben (kb. 20-szorosára) fokozta a membránvezikulák előzetes feltöltése koleszterinnel (ábrán nem bemutatott eredmények). A transzport specifikusságát a Ko143 gátlószer alkalmazásával iga-zoltuk. Ezekben a mérésekben vizsgáltuk más szterolok hatását is, azonban sem az ergoszterol, sem a szitoszterol, sem a hidrokortizon nem fokozta az ABCG2-függő drog transzportot.

Összefoglalva, sikerült bemutatnunk, hogy a membrán koleszterin-tartalma jelentős mértékben, szelektíven és reverzibilisen képes modulálni az ABCG2 transzportaktivitását. Ez a megfigyelésünk felhívja a figyelmet a plazmamembrán magas koleszterintartalmú mikro-domén struktúráinak és az ABCG2 kölcsönhatásának jelentőségére, ugyanis ezek az interakciók az ABCG2 működésének finom szabályozását teszik lehetővé. Hasonlóképpen az intracelluláris kompartmentekben kifejeződő ABCG2 transzportaktivitását is befolyásolhatja a mikrokörnyezet koleszterin tartalma. Gyakorlati szempontból pedig eredményeink jelentős mértékben növelhetik az ABCG2 fiziológiai és farmakológiai szubsztrátjainak feltérképezését célzó vizsgálatok hatékonyságát, amennyiben az alkalmazott tesztrendszerek kihasználják a koleszterinnek ezt a moduláló hatását.

4.2.3. Az ABCG2 multidrog transzporter GFP-vel való címkézése