Az ABCG1 fehérje funkcionális jellemzése

Ahogy a bevezetőben szó esett róla, az ABCG1 és különösen az ABCG4 két kevéssé ismert ABC transzporter. Mindkettő az ABCG alcsaládba tartozó féltranszporter, és rendkívül nagyfokú szekvencia-azonosságot mutatnak. Az ABCG1 és ABCG4 transzporterek tanulmá-nyozásánál nemcsak a kevés rendelkezésre álló információ, hanem a megfelelő ellenanyag hiánya is nehézséget jelentett. Az ABCG1 és ABCG4 vizsgálatát tehát specifikus ellenanyagok előállításával kezdtük. A fehérjék N-terminális citoplazmatikus részével immunizáltunk állatokat, és differenciális szűréssel teszteltük a kapott szérumokat. A megfelelő érzékenységű és szelektivitású poliklonális ellenanyagot termelő állatokat felhasználva, később több lépésben specifikus monoklonális ellenanyagot állítottunk elő.

A legtöbb ABC fehérje az ATP kötéséből és hidrolíziséből biztosítja a transzport-funkciójához szükséges energiát. Több ABC transzporter biokémiai vizsgálatához használtuk korábban az Sf9 rovarsejtes heterológ expressziós rendszert, melyben a fehérje nagy mennyiségben előállítható. A transzporterek jellemzésére, szubsztrátjainak, illetve gátló-szereinek feltérképezésére az Sf9 membránpreparátumokon végzett vanadát-szenzitív ATPáz aktivitás mérést használtuk, mivel jellemzően a transzportált szubsztrát fokozza, a transzportot gátló anyag pedig gátolja a transzporter ATPáz aktivitását is [8]. A korábban szerzett tapasztalatainkra építve, az ABCG1 és az ABCG4 fehérjéket is kifejeztettük Sf9 sejtekben. Összehasonlítás végett elkészítettük és kifejeztettük a transzporterek katalitikus hely mutáns variánsait, melyek a Walker A motívumban lévő kritikus pozícióban egy lizin-metionin cserét tartalmaznak (KM mutánsok: ABCG1K124M, ABCG4K108M). Kontrollként a β-galaktozidázt (βgal), valamint egy ABCG2 variánst, az ABCG2R482G-t, illetve annak inaktív mutáns változatát (ABCG2R482G;K86M) tartalmazó membránokat használtunk. Az ABCG2-nek azért ezt a variánsát választottuk, mert erről kimutatták, hogy a rodamin123 festékkel kölcsönhatásba lép, amit az ABCG1 esetében is megfigyeltünk (ld. később).

A membránokban mérve a vanadát-szenzitív ATPáz aktivitást, azt tapasztaltuk, hogy mind a vad típusú ABCG1, mind a vad típusú ABCG4 - a KM mutánsokkal kapott értékeknél szignifikánsan magasabb alapaktivitást mutat (24a ábra). A mutánsok ATPáz aktivitása nem különbözött a háttértől (βgal). A vad típusú ABCG1, de különösen az ABCG4 által képviselt alapaktivitás nem volt igazán magas, messze elmaradt az ABCG2-vel kapott értéktől.

24. ábra: Az ABCG1 és ABCG4 ATPáz aktivitása. a) Az ABCG1 (G1), ABCG4 (G4), és ABCG2R482G (G2) transzportert tartalmazó Sf9 membránpreparátumokon mértük a vanadát-szenzitív ATPáz aktivitást (világos oszlopok). Negatív kontrollként egyrészt a katalitikus hely mutánsokat használtuk (KM indexek):

ABCG1K124M, ABCG4K108M, és ABCG2R482G;K86M (sötét oszlopok), másrészt β-galaktozidázt (βgal). Ez utóbbi aktivitást vonallal is jelöltük az ábrán. Az ábrán átlag ± SEM értékek szerepelnek (n > 3). A csillag a βgal aktivitásához viszonyított szignifikáns eltérést jelez az ABCG4 esetében (p < 0,001). b) G1-t és G4-t tartalmazó membránok ATPáz aktivitása rodamin123 jelenlétében. A βgal által képviselt aktivitást szaggatott vonal jelöli.

Ahogy arról szó volt az ABCG2 kapcsán, a tapasztalt alapaktivitás lehet a transzporter szétkapcsoltságának következménye vagy utalhat arra, hogy endogén szubsztrát vagy szubsztrátok vannak jelen a preparátumban. Az ABCG1 és ABCG4 szubsztrátjainak és gátlószereinek feltérképezésére megvizsgáltunk egy kb. 100 vegyületből álló molekula-könyvtárat az ATPáz mérést használva. Ezek között szerepeltek tumorellenes szerek (pl.

mitoxantron, doxorubicin), fluoreszcens vegyületek (pl. calcein AM, rodamin123), különböző ismert gátlószerek (pl. verapamil, Ko143), prosztaglandinok, hormonok, neurotranszmitterek, peptidek, konjugált molekulák, szterolok, stb.

Érdekes módon a nagyszámú vizsgálat ellenére csak két olyan vegyületet találtunk, amely az ABCG1 ATPáz aktivitását fokozta: a rodamin123 és a rodamin6G fluoreszcens molekulákat. Az előbbivel kapott koncentráció-függő stimuláló hatás látható a 24b ábrán, összehasonlítva az ABCG4 fehérjével kapott eredménnyel. Ez utóbbi esetében egyetlen vegyületet sem találtunk, amely fokozta volna az ATPáz aktivitását. Hasonló módon, ATPáz méréssel inhibitormolekulákat is próbáltunk azonosítani. Így az ABCG1-et tartalmazó membránokban a benzamil, a ciklosporin A és az L-tiroxin viszonylag alacsony koncentrációban gátolta mind az alap-, mind a rodamin123-stimulált ATPáz aktivitást (ábrán nem bemutatott eredmény, 8. közlemény 2d-f ábrák). Az ABCG4 esetében azonban gátló hatású vegyületeket sem sikerült azonosítanunk.

25. ábra: Ko-expresszált transzporterek ATPáz aktivitása. a) Sf9 rovarsejteket ko-infektáltunk ABCG1-gyel és azon felül β-galaktozidázzal (G1 + βgal), ABCG4K108M-mel (G1 + G4KM), valamint ABCG2R482G;K86M-mel (G1 + G2KM). Mértük a membránok vanadát-szenzitív alap- (világos oszlo-pok) és 100 μM rodamin123-mal stimulált (sötét oszlopok) ATPáz aktivitását. A háttéraktivitást (βgal) vonal jelöli az ábrán. Az értékek átlag ± SEM jelentenek (n > 3). b) A membránprepará-tumokban lévő fehérjék jelenlétét és az egyenlő ABCG1 expressziós szintet Western blot analízissel specifikus ellenanyagokat használva mutattuk ki.

Ismeretes, hogy az ABC féltranszportereknek dimerizálódniuk kell ahhoz, hogy működőképes egységet alkossanak. Az ABCG1 esetében mért alap- és stimulálható ATPáz aktivitás arra utal, hogy az ABCG2 transzporterhez hasonlóan, ez a fehérje homodimerként funkcionál. Az ABCG4 esetében a csekély mértékű alapaktivitásból nem célszerű bármiféle következtetést levonni. Felmerült annak lehetősége, hogy az ABCG1 és ABCG4 dimerizációs partnerek lehetnek, hiszen nagyon nagyfokú közöttük a szekvencia-azonosság, és a Drosophila ortológoknál (White, Scarlet, Brow) leírták a heterodimerizációt [111]. Az ABCG1 által képviselt ATPáz aktivitás lehetőséget adott ennek a kérdésnek a megvizsgá-lására is. Ennek érdekében Sf9 membránokban együtt expresszáltunk vad típusú ABCG1-et és ABCG4KM-et, és mértük mind az alap-, mind a rodamin123-stimulált ATPáz aktivitást. Azt tapasztaltuk, hogy az inaktív mutáns ABCG4 variáns gátolja az ABCG1 aktivitását (25a ábra), ami arra utal, hogy a két fehérje heterodimert képez. Kontrollként olyan membránokat használtunk, amelyben az ABCG1 mellett β-galaktozidázt (G1 + βgal), illetve az ABCG2 inaktív mutáns variánsát (G1 + G2KM) expresszáltuk. Egyik esetben sem tapasztaltuk a G4KM -mel látott domináns negatív hatást, bizonyítva a kölcsönhatás specifikusságát. Kritikus ezekben a kísérletekben, hogy azonos legyen az ABCG1 expressziós szintje a különböző membránpreparátumokban. Ezt Western analízissel igazoltuk (25b ábra).

Összefoglalva, sikeresen expresszáltuk a kevéssé jellemzett ABCG1 és ABCG4 féltranszportereket. Mindkét fehérje ellen sikerült specifikus monoklonális ellenanyagot előállítanunk, és mérhető ATPáz aktivitást mutattunk ki mindkettő esetében. Az ABCG1 ATPáz aktivitását a rodamin123 és a rodamin6G fluoreszcens molekulák stimulálták, ami arra utal, hogy ezek a vegyületek az ABCG1 szubsztrátjai. Ezt a későbbiekben közvetlen transzportmérésekkel nem sikerült igazolnunk. Továbbra is nyitott marad a kérdés, hogy ennek a transzporternek mi a fiziolóigás szubsztrátja. A vizsgált vegyületek között szerepeltek bizonyos szterolok is, de ezeknél nem tapasztaltunk ATPáz aktivitást fokozó hatást. Legújabb, még nem publikált eredményeink megmutatták, hogy a koleszterin és a szitoszterin koncentráció-függő módon képes fokozni az ABCG1 ATPáz aktivitását. Annak megválaszolása, hogy vajon ez a stimuláció közvetlen transzportra utal, vagy hogy az ABCG2-nél tapasztalt moduláló hatást tükröz, további vizsgálatokat igényel.

Az ABCG1 és ABCG4 szöveti eloszlása csak részben fed át. A most ismertetett eredményeink arra utalnak, hogy ezek az ABC fehérjék mind homo-, mind heterodimerként képesek funkcionálni, ami összhangban áll a részben átfedő expressziós mintázattal. A legújabb eredményeinkben közvetlen módon, ko-immunprecipitációval is megmutattuk az ABCG1 és ABCG4 között létrejövő kölcsönhatást (publikálás alatt lévő, csak konferencián bemutatott eredmények). Ez a fajta felemás kapcsolat a két fehérje között fiziológiás szempontból finom szabályozásra ad lehetőséget, amennyiben a homodimer és a heterodimer szubsztrát-specifitása, affinitási és transzportkapacitási viszonyai eltérőek. Azonban ennek felderítése, különös tekintettel a heterodimer részletes jellemzésére, további vizsgálatokat igényel.

4.3.2. Az ABCG1 fehérje apoptotikus hatása