A calcein assay diagnosztikai alkalmazása

A calcein assay egyik alkalmazási területe a multidrog fehérjék (MDR1, MRP1) transzporttulajdonságainak vizsgálata. Ahogy ezt a 4.1.1. fejezetben az MRP1 példáján bemutattuk, a módszer segítségével fel lehet térképezni a transzporterekkel kölcsönhatásba lépő anyagokat. Az ilyen jellegű farmakológiai felhasználásán túl a calcein assay alkalmas arra is, hogy különböző mintákban kvantitatívan meghatározzuk a multidrog transzporterek (MDR1, MRP1) aktivitását. A technikának az ilyen irányú felhasználása szintén fontos lehet különböző kutatási területeken, azonban még jelentősebb szerepet kaphat a klinikai diagnosztikában. A következőkben azt a munkánkat foglalom össze, mely során a calcein assay segítségével rákos betegektől kapott mintákban határoztuk meg a multidrog transzporterek aktivitását, és összevetettük a klinikai paramétereikkel.

A multidrog rezisztencia diagnosztikájának elsősorban azokban a tumorokban van jelentősége, ahol az MDR fenotípus nem kötelező módon, de gyakorta megjelenik. Az akut leukémiák ehhez a csoporthoz tartoznak, ráadásul gyakorlati szempontból egy olyan előnnyel is bírnak a szolid tumorokkal szemben, hogy a minta könnyen hozzáférhető, és a rákos sejtek izolálása nem igényel különösebb előkészítést.

A bemutatott munkában 93 de novo akut leukémiával diagnosztizált beteg mintáit vizsgáltuk meg két nagy hematológiai központban, a Debreceni Egyetemen, illetve az Országos Hematológiai Intézetben, Budapesten. A betegek közül 65-nél akut mieloid leukémiát (AML), míg 28-nál akut limfoid leukémiát (ALL) diagnosztizáltak. A betegek perifériális véréből a mononukleáris sejteket izolálva, calcein assay-vel áramlási citométerben mértük a multidrog rezisztencia transzporterek aktivitását. A vizsgálatoknál csak az élő sejt-frakciót vettük figyelembe, amit propidium-jodid (PI) festéssel, és a PI-pozitív sejtek kizárásával hajtottunk végre. Az eredményeket a bevezetésben említett MDR aktivitás faktorral fejeztük ki az (1) képlet alapján. A budapesti centrumban vizsgált betegmintákban meghatározott MAF 17,6-nak adódott az AML-es esetekben (n = 43), míg 7,8-nak az ALL-es esetekben (n = 14) (10a ábra). Az utóbbi nem különbözött szignifikánsan a nem-beteg mononukleáris sejtekben mérhető MAF értéktől (11,9 ± 6,4), míg az AML esetek szignifikáns eltérést mutattak (p < 0,05). A debreceni központban is hasonló különbséget mutattak ki az AML-es és ALL-es betegek mintái között (ábrán nem bemutatott eredmény, 3. közlemény 1a ábra). Ezek alapján a következőkben csak az AML-lel diagnosztizált betegcsoport elemzésével foglalkoztunk.

10. ábra: A calcein assay alkalmazása klinikai mintákon. a) Akut limfoid leukámiában (ALL) és akut mieloid leukémiában (AML) szenvedő betegek perifériális véréből izolált mononukleáris sejtekben calcein assay-vel (0,25 µM calcein AM, 100 µM verapamil) áramlási citométer segítségével meghatároztuk az MDR aktivitás faktort. Az oszlopokon az átlag ± SEM értékek szerepelnek (n = 14, illetve 43) b) A calcein assay prediktív értéke a terápiára adott válasz tekintetében 65 AML-es beteget vizsgálva. MDR+: aktivitás faktor > 20 (n = 26);

MDR-: aktivitás faktor < 20/25 (n = 39); R (responder): az első vagy legalább a második kezelés hatására teljes remisszióba kerülő betegek; NR (non-responder): a terápiára nem válaszoló betegek. A calcein assay-vel meghatározott MDR fenotípus pozitív prediktív érték 69 %-nak adódott, ami szignifikáns összefüggést mutatott a terápiára adott válasszal (p < 0,005) c) Az MDR fenotípus alapján két csoportba sorolt 65 AML-es beteg Kaplan-Meier túlélési görbéje (n = 26, illetve 39). Csak a 8 hónapnál hosszabb túlélési időket vettük figyelembe.

A két csoport között szignifikáns különbség mutatkozott a túlélés tekintetében is (p < 0,05).

Mindkét központban az AML-es betegeket standard, 7 + 3 remisszió indukciós kemoterápiás protokoll alapján kezelték a megfelelő kiegészítésekkel - egy vagy szükség esetén két ciklust alkalmazva. 4 hét elteltével a betegek kezelésre adott válaszát a csontvelői és perifériális vérminta morfológiája alapján értékelték. Teljes remissziónak – az ajánlások alapján - azt tekintették, ha a csontvelőben a blasztok aránya nem haladta meg az 5 %-ot, a periférián pedig egyáltalán nem volt blasztos sejt [72]. A kezelést követően meghatározva az MDR aktivitás faktort a betegek vérmintáiban, azt tapasztaltuk, hogy a terápiára reagálók (responder-ek) esetében szignifikánsan alacsonyabb értéket kaptunk, mint a nem-reagálók (non responder-ek) mintáiban. A kapott MAF értékek eloszlási görbéje alapján mindkét centrumban beállítottunk egy-egy küszöbértéket. A kisebb metodikai eltérések következtében ez az érték a budapesti központban 20-nak, míg a debreceni centrumban 25-nek adódott.

Ezek után a 65 betegmintát két csoportra (MDR-pozitív, illetve MDR-negatív) osztottuk az alapján, hogy az aktivitás faktor a megállapított küszöbértéket meghaladta vagy alatta maradt, és kiszámoltuk az egyes csoportokban a terápiára reagálók (R) és nem-reagálók (NR)

arányát. A calcein assay alapján meghatározott MDR-negativitás magas pozitív prediktív értéket adott a terápiára adott válasz tekintetében (72 %), míg az MDR-pozitív fenotípus 69 %-os eséllyel a kezelés negatív kimenetelét vetítette előre. Az esélyhányados az MDR-pozitivitás és a sikertelen terápia viszonylatában 5,7-nek adódott (95 %-os konfidencia intervallum: 1,7-19, p = 0,004). Érdekes módon a vizsgált betegcsoportban az MDR fenotípuson kívül csak a beteg kora bizonyult prognosztikai jelentőségű faktornak a kemoterápiára adott válasz tekintetében.

Megvizsgáltuk az említett két betegcsoportnál az MDR fenotípus és a hosszú távú klinikai kimenetel összefüggését. A 10c ábrán bemutatott Kaplan-Meier túlélési görbén csak azokat a betegeket vettük figyelembe, akik a diagnózist követően 8 hónapnál tovább éltek.

Azt tapasztaltuk, hogy az MDR-negatív csoportba tartozó betegek 50 %-os túlélési iedeje kb.

háromszorosa az MDR-pozitív betegekénél. Azonban statisztikailag ez a különbség nem bizonyult szignifikánsnak (p = 0,07).

Összefoglalva, ebben a munkában bemutattuk, hogy a calcein módszer alkalmas klinikai minták kvantitatív elemzésére is. Kimutattuk továbbá, hogy az ilyen módon meghatározott MDR fenotípus a de novo akut mieloid leukémiában szenvedő betegeknél prognosztikai értékkel bír a kemoterápiás kezelésre adott válasz tekintetében. A magas MDR aktivitás faktor kedvezőtlen terápiás válaszképességet vetít előre.

A jelen ismertetett munkában a calcein assay diagnosztikai célú felhasználását leukémiás mintákon mutattuk be. Érdemes azonban megemlíteni, hogy arra is erőfeszítéseket tettünk, hogy a módszert kiterjesszük a szolid tumorok MDR diagnosztikájára is. Ebből a munkából egy szabadalom született [73], azonban ennek ismertetésére ebben a disszertáció-ban nem térek ki.