Mivel a disszertációnak a elsődleges célja a tudományos teljesítmény bemutatása, és nem a kísérleti munkának a reprodukálható közlése, ezért ebben a következő fejezetben csak a legalapvetőbb metodikák vázlatos leírását adom. A több év munkája során olyan sokféle és kisebb-nagyobb részletekben különböző módszert használtunk, hogy ezeknek a részletes leírása feleslegesen növelné a dolgozat terjedelmét. Az alkalmazott metodikák részletes leírását a csatolt közlemények ide vonatkozó fejezetei tartalmazzák.
Sejttenyésztés
Minden sejtkultúrát standard körülmények között az adott sejtnek megfelelő tenyésztő médiumban tartottuk az ajánlott kiegészítésekkel. Az Sf9 (Spodoptera frugiperda) rovar sejteket 27°C-on, 10% borjúszérummal (FCS) és penicillin/streptomicin keverékkel kiegészített TNM-FH (Sigma) médiumban tenyésztettük. Az emlős sejtek esetében legtöbbször 10% FCS-sel, 1% L-glutaminnal és penicillin/streptomicin keverékkel kiegészített RPMI vagy D-MEM médiumot (Gibco) alkalmaztunk. Az emlős sejtkultúrákat 5% CO2 koncentráció mellett, 37°C-on tenyésztettük.
ABC fehérjék expressziója
Az Sf9 sejtekben a különböző ABC fehérjéket bakulovírus segítségével expresszáltuk, amihez a vírusfelülúszókat BaculoGold (Pharmingen) transzfekciós kit felhasználásával állítottuk elő általában pAcUW21-L bakulovektor használatával. Az Sf9 sejtekből az ABC transzportert tartalmazó membránok preparálására vonatkozó metodikai leírást a [8] sz.
közlemény tartalmazza. Az emlős sejtekbe tranziens transzfekcióval vagy retrovírus transzdukcióval vittük be a vizsgálni kívánt ABC fehérjét. A transzfekcióhoz Fugene 6 (Roche) transzfekciós kittet és leggyakrabban pEGFP-N1 (Clontech) vektort használtunk. Az emlős sejtek transzdukciójához pedig két-lépéses retrovírus fertőzést alkalmaztunk, amihez a vírusfelülúszót Phoenix eco, illetve PG13 pakolósejtekkel állítottuk elő.
Western blot
A mintákban lévő ABC transzporterek kimutatására általában teljes sejtlizátumokkal SDS-PAGE gélelektroforézist végeztünk, majd a fehérjéket PVDF (Bio-Rad) membránra blottoltuk át. A membránokat megfelelő blokkolás után a vizsgálni kívánt ABC fehérjére specifikus elsődleges ellenanyaggal festettük, majd tormaperoxidáz-konjugált másodlagos antitesttel (Jackson Immunoresearch) hívtuk elő, végül „enhanced chemiluminescence”
technikával (ECL, Amersham) tettük láthatóvá.
ATPáz mérés
Az Sf9 membránpreparátumok ATPáz aktivitását a felszabaduló inorganikus foszfát kolorimetriás detektálásával határoztuk meg 1 mM Na-ortovanadát jelenlétében, illetve távollétében [8] 2 mM DTT-t, 500 µM EGTA-Tris-t, 5 mM Na-azidot és 1 mM ouabaint tartalmazó 40 mM MOPS-Tris-ből és 50 mM KCl-ból álló reakcióelegyben (pH 7,0). A 20 µg fehérjét tartalmazó membránokat a vizsgálandó anyagokkal különböző koncentrációban 5 percig 37°C-on előinkubáltuk. A reakciót 3,3 mM MgATP hozzáadásával indítottuk el, és 20 perc elteltével 5% SDS hozzáadásával állítottunk le. ABC fehérjékre jellemző vanadát-szenzitív ATPáz aktivitást a vanadát jelenlétében mért aktivitás levonásával kaptuk meg.
Immunfluoreszcens jelölés
Az immunfluoreszcens festéshez a sejteket 8 lyukas LabTek II kamrán (Nunc Nalgene) vagy polarizált tenyésztés esetén Transwell Col (Corning) membránon növesztettük.
A tenyészeteket általában először 4 % paraformaldehiddel, majd előhűtött metanollal fixáltuk.
A blokkolást 2mg/ml BSA-t, 1% halzselatint, 0,1 % Triton X-100-t és 5% kecske szérumot tartalmazó Dulbecco módosított PBS (DPBS) oldattal végeztük. A megfelelő mosási lépések közbeiktatásával a vizsgálni kívánt ABC transzporterre specifikus elsődleges ellenanyaggal való inkubálást legtöbbször AlexaFluor fluorofórral konjugált másodlagos ellenanyaggal történő festés követte. A mintákat Olympus FV500-IX konfokális mikroszkóppal általában PLAPO 60× (1.4) olaj immerziós objektívvel vizsgáltuk.
A sejtfelszíni expresszió mérése
Az immunfestés előtt a sejteket tripszineztük, festettük 2 percig 10 mg/ml propidium-jodiddal (PI), majd kíméletesen fixáltuk 1% PFA-val. Az immunfestés további lépéseit 4 ºC-on végeztük. A mintákat 2 mg/ml BSA-t tartalmazó PBS oldatban 10 percig blokkoltuk.
Ezután a megfelelő elsődleges, majd általában AlexaFluor fluorofórral konjugált másodlagos antitesttel inkubáltuk 30-30 percig. A jelölést áramlási citométerrel detektáltuk (Becton Dickinson FACS Calibur). Amennyiben valamilyen tesztanyag hatását vizsgáltuk, akkor a sejteket az egész eljárás előtt még a tenyésztőedényben 4 órán keresztül inkubáltuk a vizsgálandó anyaggal. A relatív sejtfelszíni expressziót a drog kezelt és az oldószer kezelt minták mértani átlag fluoreszcencia értékeinek a hányadosával fejeztük ki.
Fluoreszcens festékfelvétel mérése
A sejteket megfelelő festékkel (0,25 μM calcein AM-mel vagy 2 μM Hoechst 33342) inkubáltuk és kevert küvettás fluoriméterrel (Hitachi) vagy konfokális mikroszkóppal követtük a fluoreszcencia intenzitás változását. A multidrog ABC transzporter festékeltávolító
aktivitását 50-100 μM verapamil, 10 μM MK571, 50 μM benzbromaron vagy 1 μM Ko143 hozzáadásával függesztettük fel. Az MDR ABC transzporter festék-eltávolító tevékenységét az MDR aktivitás faktorral (MAF) jellemeztük, amelyet a festékfelvételi sebességekből a bevezetésben leírt módon számoltunk ki (1. egyenlet). A fluoreszcens festékfelvétel áramlási citometriás méréséhez a sejteket külön csövekben azonos ideig (általában 10 percig) inkubáltuk a festékkel (0,25 μM calcein AM-mel) a gátlószer jelenlétében és távollétében. Az aktivitás faktort ekkor az azonos idők alatt felhalmozódott fluoreszcenciák alapján számoltuk.
Az áramlási citométeres méréseknél az elpusztult sejteket a PI festődés alapján kizártuk.
A festék kiáramlásának méréséhez (az efflux mérésekhez) a sejteket a festékkel inkubáltuk a megfelelő gátlószer (verapamil, Ko143) jelenlétében, majd alapos mosás után időben követtük a fluoreszcencia csökkenését a fent leírt módokon.
Némelyik vizsgálathoz módosítottuk a membránok koleszterintartalmát. A koleszterin deplécióhoz a sejteket 2,5-4 mM koncentrációjú ciklodextrinnel (CD) inkubáltuk 37 ˚C-on 20-30 percig. A koleszterinnel való feltöltéshez ugyanilyen körülmények között 4,4 % koleszterin-tartalmú CD-t használtunk.
Apoptotikus sejtek detektálása
A 8 lyukas LabTek II kamrán növesztett sejteket Alexa Fluor fluorofórral konjugált annexin V-tel (Invitrogen) inkubáltuk pár percig a megfelelő kötőpufferben (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, pH: 7,4). Amennyiben szükséges volt, a sejteket különböző tesztanyagokkal (1 μM Iressa, 100 μM L-tiroxin, 50 μM benzamil) előkezeltük 24 órával a vizsgálat előtt. Kontroll kísérletekben az apoptózist 2 nM staurosporinnal indukáltuk 5 órával a vizsgálat előtt. A kaszpáz 3 aktivitás kimutatásához az annexin V festést megelőzően 10 μM PhiPhiLuxG2D2 (Calbiochem) + 10% FCS adtunk a sejtekhez 20 percen keresztül. A minták festődését a fent specifikált konfokális mikroszkóppal végeztük. A kvantitatív kiértékeléshez a látómezőben lévő összes sejt számát DIC felvétel vagy magfestés alapján határoztuk meg.
Az eredményt az Annexin pozitív sejtek az össz-sejtszámhoz viszonyított arányában fejeztük ki legalább 6-8 látómezőt vizsgálva legalább 3 független kísérletben.
Statisztikai módszerek
Az eredményeket általában átlag ± standard hiba (SEM) formában tüntettük fel. A statisztikailag szignifikáns különbségek megítéléséhez Student t-tesztet használtunk, p < 0,05 küszöbértéket meghatározva. Az illesztéseket a legkisebb négyzetek módszerével végeztük.